温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响

D01:10.133741.ism1001053x.2009.B.B4 第31卷第3期 北京科技大学学报 Vol.31 No.3 2009年3月 Journal of University of Science and Technology Beijing Mar.2009 温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 温建康姚国成陈勃伟 黄松涛 北京有色金属研究总院生物治金国家工程实验室，北京100088 摘要研究了从紫金山铜矿生物堆浸矿堆中分离出来的浸矿菌群在不同温度下的氧化活性和对紫金山硫化铜矿石的浸出 规律，并利用变性梯度凝胶电泳法研究了15℃和30℃的菌群组成情况.结果表明：所分离的细菌的最佳生长温度为30℃，浸 出10d,铜浸出率为87.62%，在最佳生长温度以外铜浸出率都会降低：15℃和30℃的优势菌分别为Leptospirillum fer- riphilum和Acidithiobacillus thiooxidans,两个温度下均有同一种劣势菌Acidithiobacillus caldus优势菌种随温度的变化是与 菌种的性质相关的。 关键词生物浸出：微生物活性；变性梯度凝胶电泳；浸矿微生物 分类号TF18 Effect of temperature on the activity of mineral-bioleaching microorganisms and the bioleaching rate of copper WEN Jian-kang.YAO Guo-cheng,CHEN Bo-wei.HUANG Song-tao National Engineering Laboratory of Biohy drometallurgy,General Research Institue for Nonferrous Metas,Beijing 100088,China ABSTRACT Bioleaching test of Zijinshan copper sulfide ore in a shake flask was conducted at different temperatures.Bacteria cl ture from Zijinshan copper mine bioheap w as applied in this test.The highest copper leaching rate of 87.62%in 10d was achieved at 30C.Microbial community at 15 C and 30C was analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis.The dominant bacteria groups at 15 C and 30C are Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus thioxidans respectively,together with Acidithicacillus caldus accounting high proportion at both the temperatures.The change in microbial community with temperature is corelated with its characteristics. KEY WORDS bioleaching:microbial acivities denaturing gradient gel dlectrophoresis minera-bioleaching microorganisms 利用生物技术从矿石中提取金属现在己经越来 氧化还原电位，温度和02/C0.本文的目的就是 越多应用于工业生产中，其中的浸矿微生物根据 要研究不同温度对于浸矿微生物活性以及铜浸出率 温度可分为适温菌(<40℃，主要是细菌、中等嗜 的影响，并运用分子生物学的方法，分析不同温度下 热菌(40~60℃，细菌和古细菌和古细菌C60℃， 微生物的组成，更加全面地了解浸矿过程， 主要是古细菌)，而研究最多的是适温菌.适温菌 1实验材料及方法 由于生长温度与一般环境中的温度相近，因此很容 易从酸性环境中分离到.现在理论认为微生物的浸 1.1试样性质 矿过程主要是一个化学过程，但其中微生物的作用 试样采用来自福建紫金山金铜矿硫化铜矿，经对 却是不容忽视的」.矿物的氧化主要是F升的作 辊破碎机破碎至一2mm后再进球磨机磨至一43m 用，而微生物的作用主要是氧化铁和硫，提供矿物氧 占90%.矿样化学元素分析见表1所示，主要含铜 化所需的Fe升，以及维持反应所需的pH:而矿物的 矿物为蓝辉铜矿和铜蓝，其次为辉铜矿，硫砷铜矿， 氧化过程又受多种化学因素的影响，如溶液H值、极少量的黄铜矿和斑铜矿，金属硫化物为黄铁矿， 收稿日期：200803-26 基金项目：国家重点基础研究发展计划资助项目(No.2004CB619205):国家高技术研究发展计划资助项目(Na.2007AA060901) 作者简介：温建康(1966-），男，教授级高级工程师，E-maila:kang3412@126.om

温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 温建康 姚国成 陈勃伟 黄松涛 北京有色金属研究总院生物冶金国家工程实验室, 北京 100088 摘 要 研究了从紫金山铜矿生物堆浸矿堆中分离出来的浸矿菌群在不同温度下的氧化活性和对紫金山硫化铜矿石的浸出 规律, 并利用变性梯度凝胶电泳法研究了 15 ℃和 30 ℃的菌群组成情况.结果表明:所分离的细菌的最佳生长温度为 30 ℃, 浸 出 10 d, 铜浸出率为 87.62 %, 在最佳生长温度以外铜浸出率都会降低;15 ℃和 30 ℃的优势菌分别为 Leptospirillum fer￾riphilum 和 Acidithiobacillus thiooxidans, 两个温度下均有同一种劣势菌 Acidithiobacillus caldus;优势菌种随温度的变化是与 菌种的性质相关的. 关键词 生物浸出;微生物活性;变性梯度凝胶电泳;浸矿微生物 分类号 TF18 Effect of temperature on the activity of mineral-bioleaching microorganisms and the bioleaching rate of copper WEN J ian-kang, YAO Guo-cheng, CHEN Bo-wei , HUANG Song-tao National Engineering Laborat ory of Biohydromet allurgy, General Research Institue for Nonferrous Metals, Beijing 100088, C hina ABSTRACT Bioleaching test of Zijinshan copper sulfide ore in a shake flask w as conducted at different temperatures.Bacteria cul￾ture from Zijinshan co pper mine bioheap w as applied in this test .The highest copper leaching rate of 87.62 %in 10 d was achieved at 30 ℃.Microbial community at 15 ℃and 30 ℃ was analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis.The dominant bacteria g roups a t 15 ℃ and 30 ℃ are Leptospirillum ferriphilum and Acidithiobacillus thiooxidans respectiv ely , together with Acidithiobacillus caldus accounting high proportion at both the temperatures.The change in microbial community with temperature is correlated with its characteristics. KEY WORDS bioleaching;microbial activities;denaturing g radient gel electrophoresis;mineral-bioleaching microorg anisms 收稿日期:2008-03-26 基金项目:国家重点基础研究发展计划资助项目( No .2004CB619205) ;国家高技术研究发展计划资助项目( No.2007AA060901) 作者简介:温建康( 1966—) , 男, 教授级高级工程师, E-mail:kang3412@126.com 利用生物技术从矿石中提取金属现在已经越来 越多应用于工业生产中 [ 1] , 其中的浸矿微生物根据 温度可分为适温菌( 60 ℃, 主要是古细菌) , 而研究最多的是适温菌[ 2] .适温菌 由于生长温度与一般环境中的温度相近, 因此很容 易从酸性环境中分离到.现在理论认为微生物的浸 矿过程主要是一个化学过程, 但其中微生物的作用 却是不容忽视的[ 3-4] .矿物的氧化主要是 Fe 3+的作 用, 而微生物的作用主要是氧化铁和硫, 提供矿物氧 化所需的 Fe 3+, 以及维持反应所需的 pH ;而矿物的 氧化过程又受多种化学因素的影响, 如溶液 pH 值 、 氧化还原电位 、温度和 O2/CO2 [ 5] .本文的目的就是 要研究不同温度对于浸矿微生物活性以及铜浸出率 的影响, 并运用分子生物学的方法, 分析不同温度下 微生物的组成, 更加全面地了解浸矿过程 . 1 实验材料及方法 1.1 试样性质 试样采用来自福建紫金山金铜矿硫化铜矿, 经对 辊破碎机破碎至 -2 mm 后再进球磨机磨至 -43 μm 占 90 %.矿样化学元素分析见表 1 所示, 主要含铜 矿物为蓝辉铜矿和铜蓝, 其次为辉铜矿 、硫砷铜矿, 极少量的黄铜矿和斑铜矿, 金属硫化物为黄铁矿 . 第 31 卷 第 3 期 2009 年 3 月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol .31 No.3 Mar.2009 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2009.03.034

。296· 北京科技大学学报 第31卷 表1紫金山金铜矿硫化铜矿化学元素分析（质量分数） Table I Chemical composition of Zijnshan secondary copper sulfide ore % Cu Fe SiO2 Al,03 K20 Na0 Mgo Cao As 065 243 260 59.99 10.84 0067 Q039 0.055 046 0038 12菌种及培养基 条件为：首先在95℃预变性2min,接着进行30个 实验所用细菌是从紫金山金铜矿疏化铜矿生物 循环的反应(95℃变性45s54C退火45s,72℃延 堆浸矿堆中分离筛选出来的.将筛选出来的细菌在 伸1minm),最后再在72C延伸5min.将所得PCR 含有硫化铜矿粉末（一43m)的液体9K培养基中 产物参照Muyzer等9的方法利用Bio-Rad公司的 多次转接培养，并添加硫酸铜驯化，使菌株具有较高 The DCodeTM Universal Mutation Detection System 的氧化活性及耐受铜离子能力.9K培养基的组成 进行电泳分离.聚丙烯酰胺凝胶质量分数为6%，其 如下(1L):3.0g(NH4)2S04,01gKCL,0.5g 中变性剂的质量分数从40%到80%(100%的变性 K2HP04,0.5gMgs04°7H20,0.01gCa(N03)2, 剂为7molL1的尿素和质量分数为40%的去离子 44.22gFeS047H20,稀疏酸调pH至2.0. 甲酰胺)，80V的电压下60℃电泳10h,电泳完毕后 1.3不同温度下细菌的生长及氧化活性测定 将凝胶在EB中染色l5min.在紫外灯下切除 在250mL锥形瓶中加入90mL的9K培养基 DGGE(变性梯度凝胶电泳)条带，洗净后浸泡于 和10mL的接种液，用稀硫酸溶液调pH至2.0.分 50L无菌去离子水中24h以上，取2L进行PCR 别在7,10,15,20,25,30,35和40℃的摇床上培养， 扩增，扩增产物经DGGE确认为单一条带后，送交 摇床转速160rmin1,每隔24h测定培养液中的细 北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序. 菌浓度和剩余F+离子浓度，当细菌浓度不再变化 1.6分析方法 时，计数细菌浓度，计算Fe+氧化为Fe3+的氧化率. 溶液中F€2浓度用重铬酸钾法测定，采用质量 细菌计数采用血球计数板在生物相差显微镜下观 分数为2%的二苯胺磺酸钠作为指示剂.溶液pH 察. 值用Thermo Orion Model868电位pH计测定.浸 1.4不同温度下浸出实验 出液中的其他金属离子浓度用原子吸收法测定.上 在250mL锥形瓶中加入90mL的9K培养基 海正阳仪表厂UJ34D型直流电位差计用于测定氧 和10mL的接种液，并加入10g硫化铜矿粉末，用 化还原电位的变化. 稀硫酸溶液调pH至20.分别在7,10,15.20,25， 2实验结果及分析 30,35和40℃的摇床上培养.摇床转速 160rmin,每隔24h测定培养液中的氧化还原电 2.1温度对浸矿微生物活性的影响 位及铜离子浓度，当氧化还原电位不再变化时分析 温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结 浸渣中铜离子含量，计算铜的浸出率 构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性 15不同温度下微生物菌群分析 来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢.过高的环 将15℃和30℃浸出结束后的浸出液进行显微 境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的 镜观察，并做SEM分析，观察两种温度下细菌的形 温度会使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活动减 态差异.为了了解浸出液中两种温度下细菌的种群 弱.本实验研究了分离的浸矿微生物在不同温度梯 差异，将浸出液离心，参考Oved等可的方法提取 度条件下培养的生长过程，通过检测其对培养基中 DNA.以引物358FGC(5'-CCTACGGGAG- Fe2+氧化为Fe3+的变化，获得温度对实验细菌生长 GCAGCAG-3)907R(5-CCGTCAATTCMTTT- 和氧化活性的影响规律，结果见表2.结果表明，实 GAGTTT-3)扩增细菌的16 S rDNA,在正向引物 验细菌可在7~40℃间存活，最适温度为30℃. 前加有富含GC的40个碱基(CCCCCCGCCCG- 2.2温度对铜浸出率的影响 CGCCCCGGGCGGGGCGGGCGCACGCGCGG)17 经过10d的浸出，浸出环境温度对铜浸出率的 PCR反应体系为100L:20L5倍GoTaq缓冲液， 影响实验结果见表3. 6gL 25 mmol'L MgCk,2L 10mmol'L dNTP. 从表3可以看出，浸出温度是影响细菌浸铜速 两种引物分别为1L,模板DNA2L,Promega 率的关键因素，温度为30℃时铜浸出率最高，高于 GoTg聚合酶0.5L.去离子水67.5L.PCR反应 30℃或低于30℃时铜浸出率都要降低.从表中还

表 1 紫金山金铜矿硫化铜矿化学元素分析( 质量分数) Tabl e 1 Chemi cal composition of Zijinshan secondary copper sulfide ore % Cu Fe S S iO2 Al 2O3 K2O Na2O MgO CaO As 0.65 2.43 2.60 59.99 10.84 0.067 0.039 0.055 0.46 0.038 1.2 菌种及培养基 实验所用细菌是从紫金山金铜矿硫化铜矿生物 堆浸矿堆中分离筛选出来的.将筛选出来的细菌在 含有硫化铜矿粉末( -43 μm) 的液体 9 K 培养基中 多次转接培养, 并添加硫酸铜驯化, 使菌株具有较高 的氧化活性及耐受铜离子能力 .9 K 培养基的组成 如下( 1 L ) :3.0 g ( NH4 ) 2SO4, 0.1 g KCl, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4 ·7H2O, 0.01 g Ca ( NO3 ) 2, 44.22g FeSO4·7H2O, 稀硫酸调 pH 至 2.0 . 1.3 不同温度下细菌的生长及氧化活性测定 在 250 mL 锥形瓶中加入 90 mL 的 9 K 培养基 和 10 mL 的接种液, 用稀硫酸溶液调 pH 至 2.0 .分 别在 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35 和 40 ℃的摇床上培养, 摇床转速160 r·min -1 , 每隔 24 h 测定培养液中的细 菌浓度和剩余 Fe 2+离子浓度, 当细菌浓度不再变化 时, 计数细菌浓度, 计算Fe 2+氧化为Fe 3 +的氧化率 . 细菌计数采用血球计数板在生物相差显微镜下观 察. 1.4 不同温度下浸出实验 在 250 mL 锥形瓶中加入 90 mL 的 9 K 培养基 和10 mL 的接种液, 并加入 10 g 硫化铜矿粉末, 用 稀硫酸溶液调 pH 至 2.0 .分别在 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35 和 40 ℃ 的 摇 床 上 培 养, 摇 床 转 速 160 r·min -1 , 每隔 24 h 测定培养液中的氧化还原电 位及铜离子浓度, 当氧化还原电位不再变化时分析 浸渣中铜离子含量, 计算铜的浸出率. 1.5 不同温度下微生物菌群分析 将 15 ℃和 30 ℃浸出结束后的浸出液进行显微 镜观察, 并做 SEM 分析, 观察两种温度下细菌的形 态差异.为了了解浸出液中两种温度下细菌的种群 差异, 将浸出液离心, 参考 Oved 等 [ 6] 的方法提取 DNA .以 引 物 358FGC ( 5′-CC TACGGGAG￾GCAGCAG-3′) 和 907R( 5′-CCGTCAATTCM TTT￾GAGTTT-3′) 扩增细菌的 16S rDNA, 在正向引物 前加有富含 GC 的 40 个碱基( CGCCCGGGGCG￾CGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG ) [ 7] . PCR 反应体系为 100 μL :20 μL 5 倍 GoTaq 缓冲液, 6μL 25 mmol·L -1 M gCl2, 2μL 10 mmol·L -1 dNTP, 两种引物分别为 1 μL, 模板 DNA 2 μL, Promeg a GoTaq 聚合酶 0.5 μL, 去离子水 67.5 μL .PCR 反应 条件为:首先在 95 ℃预变性 2 min, 接着进行 30 个 循环的反应( 95 ℃变性 45 s, 54 ℃退火 45 s, 72 ℃延 伸 1 min) , 最后再在 72 ℃延伸 5 min .将所得 PCR 产物参照 Muyzer 等 [ 8] 的方法利用 Bio-Rad 公司的 The DCode TM Universal M utation Detectio n Sy stem 进行电泳分离.聚丙烯酰胺凝胶质量分数为6 %, 其 中变性剂的质量分数从 40 %到 80 %( 100 %的变性 剂为 7 mol·L -1的尿素和质量分数为 40 %的去离子 甲酰胺) , 80 V 的电压下 60 ℃电泳 10 h, 电泳完毕后 将凝胶在 EB 中染色 15 min .在 紫外灯下切除 DGGE( 变性梯度凝胶电泳) 条带, 洗净后浸泡于 50 μL无菌去离子水中 24 h 以上, 取 2 μL 进行 PCR 扩增, 扩增产物经 DGGE 确认为单一条带后, 送交 北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序. 1.6 分析方法 溶液中 Fe 2+浓度用重铬酸钾法测定, 采用质量 分数为 2 %的二苯胺磺酸钠作为指示剂.溶液 pH 值用 Thermo Orion M odel 868 电位 pH 计测定 .浸 出液中的其他金属离子浓度用原子吸收法测定.上 海正阳仪表厂 UJ34D 型直流电位差计用于测定氧 化还原电位的变化 . 2 实验结果及分析 2.1 温度对浸矿微生物活性的影响 温度通过影响蛋白质 、核酸等生物大分子的结 构与功能以及细胞结构如细胞膜的流动性及完整性 来影响微生物的生长 、繁殖和新陈代谢 .过高的环 境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活, 而过低的 温度会使酶活力受到抑制, 细胞的新陈代谢活动减 弱 .本实验研究了分离的浸矿微生物在不同温度梯 度条件下培养的生长过程, 通过检测其对培养基中 Fe 2+氧化为 Fe 3 +的变化, 获得温度对实验细菌生长 和氧化活性的影响规律, 结果见表 2 .结果表明, 实 验细菌可在 7 ～ 40 ℃间存活, 最适温度为 30 ℃. 2.2 温度对铜浸出率的影响 经过 10 d 的浸出, 浸出环境温度对铜浸出率的 影响实验结果见表 3 . 从表 3 可以看出, 浸出温度是影响细菌浸铜速 率的关键因素, 温度为 30 ℃时铜浸出率最高, 高于 30 ℃或低于30 ℃时铜浸出率都要降低 .从表中还 · 296 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 31 卷

第3期 温建康等：温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 ·297。 表2温度对实验细菌生长和氧化活性影饷 可以知道：浸出温度为30℃时矿浆电位上升的最 Table 2 Effect of temperature on the gmw th of bacteria and their oxi- 多，具有细菌浸铜的最佳环境，因此浸铜速度最快， dation activity 铜的浸出率最高：浸出温度为7℃时，整个浸出过程 温度/℃ Fe+氧化为Fe+的 细菌浓度/ 中，矿浆电位值基本未变，此时的细菌活性受到抑 氧化率/% (10?mL-) 制，生物氧化铜矿物的速度很慢，故铜的浸出率最 0 24 低：当浸出温度为40℃时，矿浆电位显著降低.说明 b 20 40 该浸矿菌不耐高温，在高温环境下活性降低.但从 15 38 5.4 20 100 68 化学反应的角度考虑，高温环境比低温条件下有利 25 100 7.1 于化学反应的进行，故在40℃高温条件下铜的浸出 30 100 89 率比7℃低温时高 35 86 7.0 2.3温度对浸矿体系中微生物种群结构变化的影 40 46 32 响 表3 浸出温度对铜沒出率的影响 2.3.1不同温度下菌群的形貌特征 Table3 Effect of temperature on copper leaching rate 在20~30℃时，该菌群的Fe2+氧化速率均能 浸出 初始时电位/ 结束时电位/ 铜浸出 达到100%，且对应的细菌浓度和铜浸出率也较高， 温度/℃ m V (SCE) mV (SCE) 率% 因此本文研究了15℃和30℃两个温度的微生物种 7 432 445 55.34 群结构，分析了15℃和30℃下浸出体系中菌群的 10 432 42 6214 形貌特征，利用生物显微镜定期监测两种温度下菌 15 430 464 71.58 20 434 485 77.76 群的形态.图1为浸出后期浸出液中菌群照片.从 25 431 489 8214 图1中可以观察到两种温度下生存的细菌在形貌上 名 432 494 87.62 差别很大.30℃下的菌体多呈短杆状，而15℃下的 35 430 460 8023 菌体细长.进行生物扫描电镜的表征后，其形貌特 40 427 325 7488 征的差别更加显著，见图2.可以清楚判断30℃下 (b) 10m 10μm 图1不同浸出温度下细瞄的光学显微镜照片.(a)30℃，(b)15℃ Fig.1 Optical phot ographs of bacteria at different leaching temperat ures:(a)30 C:(b)15 C 2mm00k8 图2不同浸出温度下细菌的SEM形貌.(30℃，(b)15℃ Fig 2 SEM miemgraphs of bacteria at different leaching temperatures (a)30 C:(b)15 C

表 2 温度对实验细菌生长和氧化活性影响 Table 2 Eff ect of t emperature on the g row th of bacteria and their oxi￾dation activity 温度/ ℃ Fe 2+氧化为 Fe 3+的 氧化率/ % 细菌浓度/ ( 10 7 mL -1 ) 7 0 2.4 10 20 4.0 15 38 5.4 20 100 6.8 25 100 7.1 30 100 8.9 35 86 7.0 40 46 3.2 表 3 浸出温度对铜浸出率的影响 Tabl e 3 Effect of temperature on copper leaching rate 浸出 温度/ ℃ 初始时电位/ m V ( SCE) 结束时电位/ mV (SCE) 铜浸出 率/ % 7 432 445 55.34 10 432 452 62.14 15 430 464 71.58 20 434 485 77.76 25 431 489 82.14 30 432 494 87.62 35 430 460 80.23 40 427 325 74.88 可以知道:浸出温度为 30 ℃时矿浆电位上升的最 多, 具有细菌浸铜的最佳环境, 因此浸铜速度最快, 铜的浸出率最高;浸出温度为 7 ℃时, 整个浸出过程 中, 矿浆电位值基本未变, 此时的细菌活性受到抑 制, 生物氧化铜矿物的速度很慢, 故铜的浸出率最 低 ;当浸出温度为 40 ℃时, 矿浆电位显著降低, 说明 该浸矿菌不耐高温, 在高温环境下活性降低 .但从 化学反应的角度考虑, 高温环境比低温条件下有利 于化学反应的进行, 故在 40 ℃高温条件下铜的浸出 率比 7 ℃低温时高. 2.3 温度对浸矿体系中微生物种群结构变化的影 响 2.3.1 不同温度下菌群的形貌特征 在 20 ～ 30 ℃时, 该菌群的 Fe 2 +氧化速率均能 达到 100 %, 且对应的细菌浓度和铜浸出率也较高, 因此本文研究了 15 ℃和 30 ℃两个温度的微生物种 群结构, 分析了 15 ℃和 30 ℃下浸出体系中菌群的 形貌特征, 利用生物显微镜定期监测两种温度下菌 群的形态 .图 1 为浸出后期浸出液中菌群照片.从 图 1 中可以观察到两种温度下生存的细菌在形貌上 差别很大 .30 ℃下的菌体多呈短杆状, 而 15 ℃下的 菌体细长 .进行生物扫描电镜的表征后, 其形貌特 征的差别更加显著, 见图2 .可以清楚判断30 ℃下 图 1 不同浸出温度下细菌的光学显微镜照片.( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ Fig.1 Opti cal phot ographs of bact eria at different leaching temperatures:( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ 图 2 不同浸出温度下细菌的 SEM 形貌.( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ Fig.2 SEM micrographs of bacteria at diff erent leaching temperatu res:( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ 第 3 期 温建康等:温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 · 297 ·

。298 北京科技大学学报 第31卷 存活的细菌主要为杆菌，大小为(0.4~0.6)m× 优势菌的PCR产物序列与Leptospirillum fer- (0.9~1.9)m:而15℃下的细菌为螺旋菌，大小为 iphilum的相似值为99.2%.30C浸出体系样品中 (0.3-0.5)m×(0.9~25)m. 优势菌的PCR产物序列与Acidithiobacil lus thioox- 23.2不同温度下菌群的组成 idas相似值为99.8%：两个样品中均存在同一种 分子生物学技术用于微生物生态学研究中能够 生长劣势菌，其PCR产物序列与Acidithiobacillus 快速有效地分析群落中微生物的组成，它可以避免 cald的相似值为99.5%.虽然浸出起始时15℃ 传统分离培养中筛选作用所造成的微生物多样性丢 和30℃的细菌相同，但是在15℃时，已经不是上述 失问题，而且能够直接可靠地反映生态系统中微生 三种菌的最佳生长温度，由于Leptospirillum fer- 物多样性及种群分布情况习.本文采用微生物生态 riphilum能够耐受较低的温度，仍能氧化Fe2+,所 学中常用的一种分子生物学技术DGGE对浸出液 以在15℃成为优势菌，在30℃时Acidithiobacillus 中的微生物组成进行分析，通过DGGE技术可以将 thiooxidans成为优势菌. PCR扩增到的同样长度但具有不同序列的DNA片 断分离. 3结论 国外已有将该技术应用于浸矿体系微生物种群 从福建紫金山金铜矿硫化铜矿生物堆浸矿堆中 研究的相关报道1：山，但国内在这方面的研究很 分离到的浸矿微生物最佳的生长温度为30℃.在 少.本文利用PCR-DGGE技术对不同温度下的浸 此温度下具有较高的浸矿旷性能.紫金山金铜矿硫化 矿体系中微生物种群组成进行了分析.通过PCR 铜矿石浸出10d,铜浸出率为87.62%，在相同的浸 扩增后得到大约6O0bp(base pair,碱基对)的扩增 出时间内高于30℃或低于30℃铜浸出率都要降 产物，将两个样品的PCR扩增产物进行DGGE分 低.通过比较15℃和30℃的下细菌的形貌发现， 析，使得不同序列的片段得以分离.结果表明，两个 15℃下存活的细菌为螺旋菌，30℃下的细菌为杆 样品中均有两个条带得以分离.根据“DGGE条带 菌.进一步的分子生物学分析表明，15℃浸出体系 数代表微生物种类丰度，条带亮度代表种群的优劣 样品中优势菌为Leptospirillum ferriphilum,30℃ 势”的原理，可以判断两个样品中至少均含有两种不 浸出体系样品中优势菌为Acidithiobacillus thiooxi- 同的微生物，其中一种微生物为优势菌。对分离开 das两个样品中均存在同一种生长劣势菌 的条带切胶回收，以回收到的片段为模板，以358F Acidithiobacillus caldus.优势菌种随温度的变化是 和907R为引物，对片段进行二次扩增，得到大量的 与菌种的性质相关的. PCR扩增产物，见图3，其中()是30C样品的产 物，(b)是15℃样品的产物. 参考文献 [I]Ehrlich H L.Past.present and future of biohydmometallurgy. (b) Hydrometallurgy.2001.59(2/3):127 [2 Raw lings D E,Dew D.Chris D.Biomineralization of metacon- tairing ores and concentrates.Trends Bidechnd.2003,21(1): 38 3 Sand W,Gehrke T,Jozsa P G,et al Bio)chemistry of bacterial leaching drect vs.indirec bioleaching.Hydrometallurgy. 2001,592/3):159 [4 Raw lings D E.Characteristics and adaptalility of iron and sulfur- oxidizing micmorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates.Micb Cell Fact.2005.4(1): 13 [5 Brierky C L.Bacteria succession in hioheap leaching.Hydromet- allurgy,2001,59(2y3):249 图3PCR二次扩增产物的电泳照片.(30℃(b)15℃ [6 Oved T.Shaviv A.Goldrath T.et al.Influence of effluent irri- Fig.3 Electmophoresis pictures of secondary PCR amplification gation on community com position and function of ammonia-oxidz pmoducts:(a)30 C:(b)15 C ing bacteria in soil.Appl En viron Microbiol,2001,67(8):3426 [7 Demergasso C S,Galleguilbs P,Escudero G,et al.Molecular 扩增产物测序后，将所得序列在NCBL网站上 characterization of micmobial populations in a low-grade copper ore 的Blast软件比较.结果显示：15℃浸出体系样品中 bioleaching test heap.Hydrometallurgy.2005.80(4):241

存活的细菌主要为杆菌, 大小为( 0.4 ～ 0.6) μm × ( 0.9 ～ 1.9) μm ;而 15 ℃下的细菌为螺旋菌, 大小为 ( 0.3 ～ 0.5) μm ×( 0.9 ～ 2.5) μm . 2.3.2 不同温度下菌群的组成 分子生物学技术用于微生物生态学研究中能够 快速有效地分析群落中微生物的组成, 它可以避免 传统分离培养中筛选作用所造成的微生物多样性丢 失问题, 而且能够直接可靠地反映生态系统中微生 物多样性及种群分布情况[ 9] .本文采用微生物生态 学中常用的一种分子生物学技术 DGGE 对浸出液 中的微生物组成进行分析, 通过 DGGE 技术可以将 PCR 扩增到的同样长度但具有不同序列的 DNA 片 断分离. 国外已有将该技术应用于浸矿体系微生物种群 研究的相关报道[ 10-11] , 但国内在这方面的研究很 少.本文利用 PCR-DGGE 技术对不同温度下的浸 矿体系中微生物种群组成进行了分析 .通过 PCR 扩增后得到大约 600 bp( base pair, 碱基对) 的扩增 产物, 将两个样品的 PCR 扩增产物进行 DGGE 分 析, 使得不同序列的片段得以分离 .结果表明, 两个 样品中均有两个条带得以分离 .根据“DGGE 条带 数代表微生物种类丰度, 条带亮度代表种群的优劣 势”的原理, 可以判断两个样品中至少均含有两种不 同的微生物, 其中一种微生物为优势菌.对分离开 的条带切胶回收, 以回收到的片段为模板, 以 358F 和 907R 为引物, 对片段进行二次扩增, 得到大量的 PCR 扩增产物, 见图 3, 其中( a) 是 30 ℃样品的产 物, ( b) 是 15 ℃样品的产物. 图 3 PC R 二次扩增产物的电泳照片.( a) 30 ℃;(b) 15 ℃ Fig.3 Electrophoresis pictures of secondary PC R amplification products:( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ 扩增产物测序后, 将所得序列在 NCBI 网站上 的 Blast 软件比较.结果显示 :15 ℃浸出体系样品中 优势 菌的 PCR 产物 序列与 Leptospirillum fer￾riphilum 的相似值为 99.2 %, 30 ℃浸出体系样品中 优势菌的PCR 产物序列与 Acidithiobacillus thioox￾idans 相似值为 99.8 %;两个样品中均存在同一种 生长劣势菌, 其 PCR 产物序列与 Acidithiobacillus caldus 的相似值为 99.5 %.虽然浸出起始时 15 ℃ 和 30 ℃的细菌相同, 但是在 15 ℃时, 已经不是上述 三种菌的最佳生长温度, 由于 Leptospirillum fer￾riphilum 能够耐受较低的温度, 仍能氧化 Fe 2 + , 所 以在 15 ℃成为优势菌, 在 30 ℃时 Acidithiobacillus thiooxidans 成为优势菌 . 3 结论 从福建紫金山金铜矿硫化铜矿生物堆浸矿堆中 分离到的浸矿微生物最佳的生长温度为 30 ℃.在 此温度下具有较高的浸矿性能.紫金山金铜矿硫化 铜矿石浸出 10 d, 铜浸出率为 87.62 %, 在相同的浸 出时间内高于 30 ℃或低于 30 ℃铜浸出率都要降 低 .通过比较 15 ℃和 30 ℃的下细菌的形貌发现, 15 ℃下存活的细菌为螺旋菌, 30 ℃下的细菌为杆 菌 .进一步的分子生物学分析表明, 15 ℃浸出体系 样品中优势菌为 Leptospirillum ferriphilum, 30 ℃ 浸出体系样品中优势菌为 Acidithiobacillus thiooxi￾dans, 两 个 样品 中 均 存 在 同 一 种 生 长 劣 势 菌 Acidithiobacillus caldus .优势菌种随温度的变化是 与菌种的性质相关的. 参 考 文 献 [ 1] Ehrlich H L .Past, present and future of biohydrometallurgy . Hydrometallurgy, 2001, 59( 2/ 3) :127 [ 2] Raw lings D E, Dew D, Chris D .Biomineralization of met al-con￾taining ores and concentrates.Trends Biot echnol, 2003, 21 ( 1 ) : 38 [ 3] Sand W, Gehrke T, Jozsa P G, et al.( Bio) chemistry of bacterial leaching:direct vs.indirect bioleaching. Hydrometallurgy , 2001, 59( 2/ 3) :159 [ 4] Raw lings D E .Characteristics and adaptability of iron and sulfur￾oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrat es.Mi crob Cell Fact, 2005, 4( 1 ) : 13 [ 5] Brierley C L.Bacteria successi on in bioheap leaching .Hydromet￾allurgy, 2001, 59( 2/ 3) :249 [ 6] Oved T, Shaviv A, Goldrath T, et al.Influence of effluent irri￾gation on community com position and function of ammonia-oxidiz￾ing bacteria in soil.Appl En viron Microbiol, 2001, 67( 8) :3426 [ 7] Demergasso C S, Galleguillos P, Escudero G, et al.Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper ore bioleaching test heap.Hydrometa llurgy, 2005, 80( 4) :241 · 298 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 31 卷

第3期 温建康等：温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 ·299。 [8]Muyzer G.De Waal E C.Uit ierlinden A G.Profiling of complex [10 Kinmunen P H M.Puhakka J A.High-rate ferric sulfate genera micmbial populations by denaturing gradent gel electrophoresis tion by a Leptospirillium ferriphilum-dominated biofilm and analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for the mle of jarosite in biomass retainment in a fluidized-bed reac- 16S rRN A.Appl Envirn Microbiol,1993.59(3):695 tor.Biotechnol Bioeng.2004.85(7):697 [9]Coram-Uliana N J.van Hille R P.Kohr W J.et al.Development [11]Gonzalez-Toril E,Llobet-Brossa E.Casamayor E O.et al.Mi- of a method to assay the micmbial population in heap biokaching crobial ecology of an extreme acidic environment,the Tinto Riv- operat ions.Hydrometallurgy,2006,83(1/4):237 er.Appl En viron Microbiol,2003.69(8):4853 (上接第294页) [7]Liu Y,Cao Z D.Wang S.Contrasting experiment betw een acti- NO:over activated carbon fibers.Carlon,2000,38(1):227 vat ed carbon fiber and granular acti vated carbon in desulfurization 12]Liu Z Y.Zheng J T.Wang M Z.et al.Surface and porous from fhe gas.J Xi'an Jicotong Univ,2002,36(7):701 stmucture analysis of PAN-based activated earbon fibers.ChinJ (刘义，曹子栋，王盛.活性炭纤维与柱状活性炭用于烟气脱 Chem Phys,2000,13(4):473 硫的对比实验.西安交通大学学报，2002,36(7)：701) (刘振宇，郑经堂，王茂章，等.PAN基活性炭纤维的表面及 [8]Fan HJ.Zhu J,Liu JS,et.al.Progs of study on desulfuriza 其孔隙结构解析.化学物理学报，2000.13(4)：473) tion and denit rification with activated carbon fibers.Power Eng. [13 Fang JZ Li YY.Xu C F.Error amlysis of singh pint BET 2005,105):724 method with ASAP2010.China Meas Technol.2006,9(5): (范浩杰，朱敬，刘金生，等。活性炭纤维脱硫、脱硝的研究进 42 展.动力工程，2005.10(5)：724) (房俊卓，李媛媛，徐崇福.物理吸附分析仪单点BET方法 [9]Mangun CL DeBarr JA,Ecoromy J.Adsorption of sulfur diox- 误差分析.中国测试技术，2006.9(5)：42) ide on ammonia treat ed activated carbon fibers.Carbon,2001. [14 Bochm H P.Some aspect s of the saurace chemistry of carbon 39:1689 blacks and other carbons Carbon.1994.32(5):759 [10 Raymund P E.Cazorla A D,Sainas M L C,et al.Factors [15]Tsuji K,Shiraishi I Comlined desulfurization,denit rification controlling the S02 removal by porous carbons:Relevance of SO2 and reduction of air toxics usingactivated coke:II Proces appl- oxidation step.Carbon,2000.38(3):335 cations and performance of activated coke.Fuel.1997.76(6): [1l]Mochida I,Korai Y,Shirahama M,et al.Removal of SO,and 555

[ 8] Muyzer G, De Waal E C, Uitierlinden A G .Profiling of complex microbial populations by denaturing g radient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA .Ap pl Environ Microbiol, 1993, 59( 3) :695 [ 9] Coram-Uliana N J, van Hille R P, Koh r W J, et al.Developmen t of a method t o assay the microbial population in heap bioleaching operations.Hydrometallurgy, 2006, 83( 1/ 4) :237 [ 10] Kinnunen P H M, Puhakka J A.High-rat e f erric sulfate genera￾tion by a Lep tospirillium ferriphilum-dominat ed biofilm and the role of jarosit e in biomass retainment in a fluidized-bed reac￾tor .Biotechnol Bioeng , 2004, 85( 7) :697 [ 11] Gonz′alez-Toril E, Llobet-Brossa E, Casamayor E O, et al.Mi￾crobial ecology of an extreme acidic environment, the Tinto Riv￾er .Appl En viron Mi crobiol, 2003, 69( 8) :4853 ( 上接第 294 页) [ 7] Liu Y, Cao Z D, Wang S .Contrasting experiment betw een acti￾vat ed carbon fiber and granular acti vated carbon in desulfurization from flue gas.J X i' an Jiaotong U niv , 2002, 36( 7) :701 ( 刘义, 曹子栋, 王盛.活性炭纤维与柱状活性炭用于烟气脱 硫的对比实验.西安交通大学学报, 2002, 36( 7) :701) [ 8] Fan H J, Zhu J, Liu J S , et, al.Prog ress of study on desulfuriza￾tion and denitrification w ith activat ed carbon fibers.Power E ng, 2005, 10( 5) :724 ( 范浩杰, 朱敬, 刘金生, 等.活性炭纤维脱硫、脱硝的研究进 展.动力工程, 2005, 10( 5) :724) [ 9] Mangun C L, DeBarr J A, Economy J.Adsorption of sulfur diox￾ide on ammonia treat ed activated carbon fibers.Carbon , 2001, 39:1689 [ 10] Raymundo P E, Cazorla A D, Salinas M L C, et al.Fact ors controlling the SO2 removal by porous carbons:Relevance of SO2 oxidati on step.Carbon, 2000, 38( 3) :335 [ 11] Mochida I, Korai Y, Shirahama M, et al.Removal of SO x and NOx over activat ed carbon fibers.Carbon , 2000, 38( 1) :227 [ 12] Liu Z Y, Zheng J T, Wang M Z, et al.Surface and porous structure analysis of PAN-based activated carbon fibers.Chin J Chem Phys, 2000, 13( 4) :473 ( 刘振宇, 郑经堂, 王茂章, 等.PAN 基活性炭纤维的表面及 其孔隙结构解析.化学物理学报, 2000, 13( 4) :473) [ 13] Fang J Z, Li Y Y, Xu C F.Error analysis of single point BET method w ith ASAP2010.China Meas Technol, 2006, 9 ( 5 ) : 42 ( 房俊卓, 李媛媛, 徐崇福.物理吸附分析仪单点 BET 方法 误差分析.中国测试技术, 2006, 9( 5) :42) [ 14] Boehm H P .Some aspect s of the su rf ace chemistry of carbon blacks and other carbons.Carbon, 1994, 32(5) :759 [ 15] Tsuji K, S hiraishi I.Combined desulfurization, denitrification and reduction of air toxics using acti vated coke :Ⅱ Process appli￾cations and performance of activated coke .Fuel, 1997, 76( 6) : 555 第 3 期 温建康等:温度对浸矿微生物活性及铜浸出率的影响 · 299 ·