A260/A2602s作纵轴,T作横轴,画出小牛胸腺DNA的熔解曲线,并求出Tm。 方法二:用普通恒温水浴的方法测量Tm 将恒温水浴的温度分别设为50℃、70℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃ 92℃、94℃、96℃、98℃和100℃,往15支试管中各加入标准DNA溶液3ml,盖上橡 皮塞或包上塑料薄膜。100℃水浴锅中放两支,其余12个恒温浴中各放一支。剩下一支 室温放置,并测量其A260,即为基准值A2025。将100℃水浴锅中的一支试管,连同水 浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温,放置1小时后再测其A260。其余试管均温浴15分钟 后,取出迅速放入冰水中,冷却10分钟以上,由冰水中取出就立即测量A260,即为各 A260 紫外分光光度计要提前打开,调好零点,做好准备。用溶解DNA的缓冲液作参比 测完后,以A260A6025τ为纵轴,T为横轴作图(去除100℃加热,室温下缓慢冷 却的点),求出小牛胸腺DNA的Tm。(取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出 Tm。) 五、思考问题 1、DNA变性后,为什么会产生增色效应? 2、予测并解释下列条件对天然DNA的Tm的影响。 (1)pH=12的缓冲液 (2)蒸馏水 (3)50%的甲醇 (4)1%SDS-0.15 mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠(pH70) 3、根据%GC=24(Tm-69.3),计算小牛胸腺DNA的GC碱基对的含量,并解释为 什么GC碱基对的含量与Tm呈正比关系。 4、100℃温浴15分钟后,迅速冷却与缓慢冷却的DNA溶液的Ax6o有什么不同?为 什么?208 A260,T / A260,25℃作纵轴，T 作横轴，画出小牛胸腺 DNA 的熔解曲线，并求出 Tm。 方法二：用普通恒温水浴的方法测量 Tm。 将恒温水浴的温度分别设为 50℃、70℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、 92℃、94℃、96℃、98℃和 100℃，往 15 支试管中各加入标准 DNA 溶液 3ml，盖上橡 皮塞或包上塑料薄膜。100℃水浴锅中放两支，其余 12 个恒温浴中各放一支。剩下一支 室温放置，并测量其 A260，即为基准值 A260,25℃。将 100℃水浴锅中的一支试管，连同水 浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温，放置 1 小时后再测其 A260。其余试管均温浴 15 分钟 后，取出迅速放入冰水中，冷却 10 分钟以上，由冰水中取出就立即测量 A260，即为各 A260,T。 紫外分光光度计要提前打开，调好零点，做好准备。用溶解 DNA 的缓冲液作参比。 测完后，以 A260,T/ A260,25℃为纵轴，T 为横轴作图（去除 100℃加热，室温下缓慢冷 却的点），求出小牛胸腺 DNA 的 Tm。（取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出 Tm。） 五、思考问题 1、DNA 变性后，为什么会产生增色效应？ 2、予测并解释下列条件对天然 DNA 的 Tm 的影响。 （1）pH=12 的缓冲液 （2）蒸馏水 （3）50% 的甲醇 （4）1% SDS－0.15mol/L NaCll－0.015mol/L 柠檬酸钠（pH7.0） 3、根据%GC=2.4（Tm－69.3）,计算小牛胸腺 DNA 的 GC 碱基对的含量，并解释为 什么 GC 碱基对的含量与 Tm 呈正比关系。 4、100℃温浴 15 分钟后，迅速冷却与缓慢冷却的 DNA 溶液的 A260 有什么不同？为 什么？