本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺DNA的熔解温度,有两种方法可供选择。 方法一:需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计,其温度在 25~100℃之间可调,要使用高沸点溶剂(如乙二醇)作为循环液体。把装有DNA标准 溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中,按不同的温度间隔升高温度,平 衡后,测量其260nm处的紫外吸收(A260)。要考虑到,在加热过程中,水体积增加会使 DNA浓度降低。 另一种方法是,取一支装有DNA溶液的试管,测量其25℃时的A26。然后将几管 装有同样DNA溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15分钟后迅速将试管放在冰 浴中冷却,然后迅速测量其A260。这种方法的主要缺点是变性DNA冷却后引起DNA双 链的部分再结合,所以A260的增加一般只有10~20%。 三、番材与试剂 1.紫外分光光度计 2.超级恒温水浴 3.普通恒温水浴 4.石英比色杯(带盖) 5.冰浴桶 6.水浴锅 7.试管 8.缓冲液:0.015mo柠檬酸钠—0.15mol/L氯化钠溶液 9DNA溶液:用实验五所得小牛胸腺DNA和缓冲液,配制A260=0.4左右的DNA 标准溶液。溶解此DNA需较长时间的搅拌 四、操作步骤 方法一:用超级恒温水浴测量Tm 打开分光光度计,予热20分钟,将超级恒温水浴的温度设为25℃,以测量起始的 光吸收,将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准DNA溶液的样品比色杯放入 分光光度计的样品池架中的相应位置。放置3分钟,使比色杯内外的温度达到平衡,将 此时的参照杯A260调为零,记下此时的DNA的样品的A260,这个测量要十分小心,因 为所有测量值都要与25℃的这个值进行比较。然后,将温度升至50℃,取出比色杯,轻 叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架,测量后继续加热至80℃,平衡5 分钟后,记下其A260,再升高2℃,平衡5分钟后记下其A260,重复此操作步骤至A26 达到恒定值。可以注意到在一个5~10℃的温度范围内,A260有一个较大幅度的增加。根 据不同温度下水的体积变化对不同温度下的A260(即A260.)进行补偿后,以207 本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺 DNA 的熔解温度，有两种方法可供选择。 方法一：需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计，其温度在 25～100℃之间可调，要使用高沸点溶剂（如乙二醇）作为循环液体。把装有 DNA 标准 溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中，按不同的温度间隔升高温度，平 衡后，测量其 260nm 处的紫外吸收（A260）。要考虑到，在加热过程中，水体积增加会使 DNA 浓度降低。 另一种方法是，取一支装有 DNA 溶液的试管，测量其 2 5℃时的 A260。然后将几管 装有同样 DNA 溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15 分钟后迅速将试管放在冰 浴中冷却，然后迅速测量其 A260。这种方法的主要缺点是变性 DNA 冷却后引起 DNA 双 链的部分再结合，所以 A260 的增加一般只有 10～20%。 三、器材与试剂 1. 紫外分光光度计 2. 超级恒温水浴 3. 普通恒温水浴 4. 石英比色杯（带盖） 5. 冰浴桶 6. 水浴锅 7. 试管 8. 缓冲液：0.015mol/L 柠檬酸钠—0.15mol/L 氯化钠溶液 9. DNA 溶液：用实验五所得小牛胸腺 DNA 和缓冲液，配制 A260= 0.4 左右的 DNA 标准溶液。溶解此 DNA 需较长时间的搅拌。 四、操作步骤 方法一：用超级恒温水浴测量 Tm 打开分光光度计，予热 20 分钟，将超级恒温水浴的温度设为 25℃，以测量起始的 光吸收，将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准 DNA 溶液的样品比色杯放入 分光光度计的样品池架中的相应位置。放置 3 分钟，使比色杯内外的温度达到平衡，将 此时的参照杯 A260 调为零，记下此时的 DNA 的样品的 A260，这个测量要十分小心，因 为所有测量值都要与 25℃的这个值进行比较。然后，将温度升至 50℃，取出比色杯，轻 叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架，测量后继续加热至 80℃，平衡 5 分钟后，记下其 A260，再升高 2℃，平衡 5 分钟后记下其 A260，重复此操作步骤至 A260 达到恒定值。可以注意到在一个 5~10℃的温度范围内，A260 有一个较大幅度的增加。根 据不同温度下水的体积变化对不同温度下的 A260（即 A260,T）进行补偿后，以