土壤酶活性测定 几种水解酶:芳基硫酸酯藤( Arylsulphatase(EC31.61),葡萄糖苷酶 - glucosidase(EC32121))和磷酸单酯酶( phosphomonoesterase(EC31.3)测定: 这三种酶的测定都是依据人工合成底物( p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate, respectively)裂解后释放的 p-nitrophenol的量来测定 Arylsulphatase(EC3.6.1):称取1g土(湿重),与4ml500mM乙酸缓冲液( acetate buffer (pH5.8)和lml底物(25mM)混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加lml灭菌蒸馏水。土壤稍 作涡旋振荡,置于旋转摇床20℃,20opm培养2h。然后,往样品中加lm无菌蒸馏水, 往对照中加1ml底物。再加入1ml500mM氯化钙和4ml500mM氢氧化钠以终止反应。悬 浮液在旋转摇床上20℃,200rpm振荡30min。9464×g离心5min,然后在400nm波长下 测定上清夜中所提取的 p-nitrophenol的颜色深度。如果是在中性条件下测定,则用蒸馏水 取代乙酸缓冲液。标准曲线制作:用蒸馏水配制 p-nitrophenol溶液,浓度范围0-s0ug/ml B- glucosidase((EC32.1.21):缓冲液换为改进的通用缓冲液( modified universal buffer (pH60)底物浓度25mM,提取液用Tris缓冲液(pH2.0) phosphomonoesterase(EC3.1.3):缓冲液换为改进的通用缓冲液( modified universal buffer) (pH40和90)(分别测定酸性和碱性磷酸酯酶),底物浓度为15mM。 脲藤 Urease(EC3.5.1.5) 称取5g土(湿土),加25ml脲(80mM)和20ml75mM硼酸缓冲液(pH10.0)。涡 旋振荡,旋转摇床20℃,20orpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓 冲液。4h后,处理中加2。5n灭菌蒸馏水,对照中加2。5m脲。然后用30ml酸化的2M 氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃,200rpm振荡3min。9464×g离心5min,取lm上 清夜与9ml蒸馏水、5ml水杨酸钠( sodium salicylate)/氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na盐)混允,202℃静置1h,在690n波长下测定溶液的颜色强 度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作,浓度范围 0-2.5ug/m1。 脱氢( Dehydrogenase) iNT(2(p-iodopheny 1)-3-(p-nitropheny 1)-5-phenyl tetrazolium chloride)isEE 活性(既脱氢酶活性)采用 Von mers i和 Schinner(1991)的方法测定。lg鲜土置于带盖 的玻璃瓶中,加入1.5m11 M Tris缓冲液(p7.0)和2 mI INt(5mg/m1,溶于2%体积比的 二甲替甲酰胺(N,N- dimethy formamide)中)。对照土壤加1.5 ml Tris缓冲液和2ml蒸 馏水。旋转摇床20℃,20orpm培养24h。然后,往样品中加2m蒸馏水,而往对照土样中 加2mINT。然后加10mN,N- dimethy formamide/甲醇(1:1,w/v)提取液终止反应 20℃,200rpm振荡Ih。9464×g离心5min,464m波长下测定上清夜的吸光值。对于中性 土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF( iodonitrotetrazolium chloride)( Sigma)制作标 准曲线,浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解( Fluorescein diacetate hydrolysis) 称取3g鲜土,悬浮于50ml磷酸盐缓冲液,加入250uFDA(2mgml,溶于丙酮)。对照 加25oul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃,20orpm培养4h。培养结束后,样品中加250ud蒸馏土壤酶活性测定 几种水解酶：芳基硫酸酯酶（ Arylsulphatase(EC 3.1.6.1) ） , 葡萄糖苷酶 （β-glucosidase(EC 3.2.1.21) ）和磷酸单酯酶（phosphmonoesterase(EC 3.1.3)）测定： 这三种酶的测定都是依据人工合成底物（p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively）裂解后释放的 p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)：称取 1g 土（湿重），与 4ml 500mM 乙酸缓冲液（acetate buffer） （pH5.8）和 1ml 底物（25mM）混匀。对照为 4ml 乙酸缓冲液加 1ml 灭菌蒸馏水。土壤稍 作涡旋振荡，置于旋转摇床 20℃，200rpm 培养 2h。 然后，往样品中加 1ml 无菌蒸馏水， 往对照中加 1ml 底物。再加入 1ml 500mM 氯化钙和 4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬 浮液在旋转摇床上 20℃，200rpm 振荡 30min。9464×g 离心 5min， 然后在 400nm 波长下 测定上清夜中所提取的 p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定，则用蒸馏水 取代乙酸缓冲液。标准曲线制作：用蒸馏水配制 p-nitrophenol 溶液，浓度范围 0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21)：缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer） (pH6.0);底物浓度 25mM，提取液用 Tris 缓冲液（pH12.0）. phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液（modified universal buffer） (pH4.0 和 9.0)（分别测定酸性和碱性磷酸酯酶），底物浓度为 15mM。 脲酶 Urease (EC 3.5.1.5): 称取 5g 土（湿土），加 2.5ml 脲（80mM）和 20ml 75mM 硼酸缓冲液（pH10.0）。涡 旋振荡，旋转摇床 20℃，200rpm 振荡反应 4h。对照为加 2.5ml 灭菌蒸馏水和 20ml 硼酸缓 冲液。4h 后，处理中加 2。5ml 灭菌蒸馏水，对照中加 2。5ml 脲。然后用 30ml 酸化的 2M 氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床 20℃，200rpm 振荡 30min。9464×g 离心 5min，取 1ml 上 清夜与 9ml 蒸馏 水 、 5ml 水 杨 酸钠 （ sodium salicylate ） / 氢氧 化 钠 溶液 和 2ml dichloroisocyanuric acid(Na+ 盐)混允，20±2℃静置 1h， 在 690nm 波长下测定溶液的颜色强 度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作，浓度范围 0-2.5ug/ml。 脱氢酶（Dehydrogenase）： INT（2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride）还原酶 活性（既脱氢酶活性）采用 Von Mersi 和 Schinner（1991）的方法测定。1g 鲜土置于带盖 的玻璃瓶中，加入 1.5ml 1M Tris 缓冲液（pH 7.0）和 2ml INT（5mg/ml，溶于 2%体积比的 二甲替甲酰胺（N，N-dimethylformamide）中）。对照土壤加 1.5ml Tris 缓冲液和 2ml 蒸 馏水。旋转摇床 20℃，200rpm 培养 24h。 然后，往样品中加 2ml 蒸馏水，而往对照土样中 加 2ml INT。然后加 10ml N，N-dimethylformamide/ 甲醇（1：1，v/v）提取液终止反应， 20℃，200rpm 振荡 1h。9464×g 离心 5min，464nm 波长下测定上清夜的吸光值。对于中性 土壤用蒸馏水取代 Tris 缓冲液。用 INTF（ iodonitrotetrazolium chloride）（Sigma）制作标 准曲线，浓度范围 0-27ug/ml 提取液。 荧光素二乙酸酯水解（Fluorescein diacetate hydrolysis）： 称取 3g 鲜土，悬浮于 50ml 磷酸盐缓冲液，加入 250ul FDA（2mg/ml，溶于丙酮）。对照 加 250ul 蒸馏水。土壤悬浮液在 20℃，200rpm 培养 4h。 培养结束后，样品中加 250ul 蒸馏