加工机,加入予冷的试剂a溶液60m,打碎三次,每次20秒,仃20秒。将打碎后溶液 倒入小烧杯,用高速分散器匀浆三次,每次20秒,仃20秒。 (2)将匀浆后溶液分装于两个50m离心管,仔细平衡后,用高速冷冻离心机,4℃ 10000/min,离心10min,弃去上清(脂肪层等)留沉淀, (3)将沉淀置于小烧杯,加50ml予冷a液,用高速分散器同样再匀浆分散三次,同 样4℃,10000/min,离心10min,弃去上清留沉淀。 (4)取出沉淀加6ml予冷b液,再高速分散二至三次,每次分散10秒,仃10秒。 2.裂解细胞核 将悬浮液移入250m烧杯中,在磁力搅拌器上边搅拌边滴λ8mI20‰%SDS,应观察 到溶液明显变粘稠(报告中回答:为什么?)。用55℃水浴温热10min~15min,然后在 搅拌下缓慢加入8~10 g NaCl,再搅拌l0min,使NaCl全溶,此时应观察到溶液变稀(为 什么?)。冷却至室温 3解高DNA一蛋白质复合体 (1)将溶液倒入250ml具塞三角瓶中,加入此溶液二分之一体积的d液(氯仿用于 变性蛋白质,异戊醇用于消除泡沫,也可用异丙醇、异丁醇),剧烈振荡10min,倒入 300m离心管中,4℃,10000/min,离心5~10min,用滴管取出上层水相,中层蛋白质 界面弃去,下层有机相倒入回收并。 (2)取出的上层水相重复加d液、振荡、离心,至中层界面无混浊为止, 4.提取DNA (1)将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中,边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状 DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响,若产出减少可补加或换新乙醇。(观察并解释实验 现象)(回收乙醇) (2)搅起的DNA置于已称重的小培养皿内,依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状 DNA沉淀至无浑浊为止,最后再用丙酮清洗一次,用吹风机将DNA吹干, (3)称重,并计算产率 5.测定DNA (1)准确称取50~100 mg dna,加少量0. Imol/L NaoH溶解,加HO定容至50ml。 (2)用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线,测定A260和A28, 并计算比值:A260/A280,纯DNA的此比值约为1.8。 (3)根据:每毫升1微克的纯DNA的Ax60值=0020,计算所得DNA的纯度,并讨 论纯度较低的原因和解决办法205 加工机，加入予冷的试剂 a.溶液 60ml，打碎三次，每次 20 秒，仃 20 秒。将打碎后溶液 倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次 20 秒，仃 20 秒。 ⑵ 将匀浆后溶液分装于两个 50ml 离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃， 10000r/min，离心 10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。 ⑶ 将沉淀置于小烧杯，加 50ml 予冷 a 液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同 样 4℃，10000r/min，离心 10min，弃去上清留沉淀。 ⑷ 取出沉淀加 60ml 予冷 b 液，再高速分散二至三次，每次分散 10 秒，仃 10 秒。 2. 裂解细胞核 将悬浮液移入 250ml 烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入 8ml 20% SDS，应观察 到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用 55℃水浴温热 10min～15min，然后在 搅拌下缓慢加入 8～10g NaCl，再搅拌 10min，使 NaCl 全溶，此时应观察到溶液变稀（为 什么？）。冷却至室温。 3. 解离 DNA—蛋白质复合体 ⑴ 将溶液倒入 250ml 具塞三角瓶中，加入此溶液二分之一体积的 d 液（氯仿用于 变性蛋白质，异戊醇用于消除泡沫，也可用异丙醇、异丁醇），剧烈振荡 10min，倒入 300ml 离心管中，4℃，10000r/min，离心 5～10min，用滴管取出上层水相，中层蛋白质 界面弃去，下层有机相倒入回收并。 ⑵取出的上层水相重复加 d 液、振荡、离心，至中层界面无混浊为止。 4. 提取 DNA ⑴ 将取出的水相滴入予冷的 95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状 DNA 沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。（观察并解释实验 现象）（回收乙醇）。 ⑵ 搅起的 DNA 置于已称重的小培养皿内，依次用 95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状 DNA 沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，用吹风机将 DNA 吹干。 ⑶ 称重，并计算产率。 5. 测定 DNA ⑴ 准确称取 50～100mg DNA，加少量 0.1mol/L NaOH 溶解，加 H2O 定容至 50ml。 ⑵ 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的 DNA 的紫外吸收曲线，测定 A260和 A280， 并计算比值：A260/A280，纯 DNA 的此比值约为 1.8。 ⑶ 根据：每毫升 1 微克的纯 DNA 的 A260 值= 0.020，计算所得 DNA 的纯度，并讨 论纯度较低的原因和解决办法