基因突变检测原理和流程 基因突变检测：（以EGFR基因为例) 流程： 2.PCR扩增和基因测序 1.标本采集和DNA提取： 1.肿瘤组织在手术切除后快速冻存于液 ①95℃5min变性 氮中，然后在-80℃深低温冰箱保存， ②95℃30s,57℃30s,72℃45s,40个 同时采集正常肺组织（与病灶距离5cm 循环 以上)作为对照。 ③72C延伸7min 2.组织样本(50mg）中的DNA提取按 ④扩增产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳10V 照DNAezsol基因组DNA抽提试剂盒（上 30min后，EB染色摄片 海申能博采公司)说明书操作。经 ⑤将阳性扩增条带的样本经柱层析分离纯化 Eppendorf核酸蛋白测定仪测定DNA纯 后，采用双脱氧链终止法（Sanger法)在 度及含量，要求4280/4260>1.80，调整 ABI37O0型DNA序列分析仪上进行基因测序。 DNA浓度至25jug/ml。 测序引物采用各外显子的上游引物。 6 基因突变检测原理和流程 基因突变检测：（以EGFR基因为例） 流程： 1.标本采集和DNA提取： ①95 ℃ 5min变性 ②95 ℃ 30s，57 ℃ 30s, 72 ℃ 45s, 40个 循环 ③72 ℃延伸7 min ④扩增产物经1 . 6 % 琼脂糖凝胶电泳10 V 30 m in 后 , EB染色摄片 ⑤将阳性扩增条带的样本经柱层析分离纯化 后 , 采用双脱氧链终止法 ( Sanger法)在 ABI3 700型DNA序列分析仪上进行基因测序。 测序引物采用各外显子的上游引物。 1.肿瘤组织在手术切除后快速冻存于液 氮 中, 然后 在-80 ℃ 深低温冰箱保存， 同时采集正常肺组织 ( 与病灶距离 5cm 以上 )作为对照。 2.组织样本（50 mg）中 的DNA提取按 照DNAezsol基因组DNA抽提试剂 盒（上 海申能博釆公司）说明书操作。经 Eppendorf 核酸蛋白测定仪测定DNA纯 度及含量，要求4280/ 4260 >1.80,调整 DNA 浓度至 25 jug/ml。 2.PCR扩增和基因测序