6 基因突变检测原理和流程 O●●●● 基因突变检测：（以EGFR基因为例) 反应液： PCR（用ABI Prism Primer Express软件设计)： DNA4μg(100ng） 扩增位置：EGFR外显子19 10×缓冲液5μg 引物：上游—AAC GTC TTC CTT CTC TCT CTG TCA 2.5mmol/L dNTP5μL 下游—-CCA CAC AGC AAA GCA GAA ACT 上游及下游引物(20mmol/L)各1μg 退火温度：57°C Pfu酶(2.5U/μL)1μL(DEPC-H20补充至 产物长度：150bp 50μL) 表1EGFR外显子19-21特异性引物序列 外显子 引物 序列(5'3) 退火温度（℃） G/C百分比 产物(bp) 19 上游 AAC GTC TTC CTT CTC TCT CTG TCA 57 52.4 150 下游 CCA CAC AGC AAA GCA GAA ACT 57 47.6 为了验证引物的有效性，需要再次打开NcBl,blast设计好的引物的特异性。6 基因突变检测原理和流程 基因突变检测：（以EGFR基因为例） PCR（用ABI Prism Primer Express软件设计）： 扩增位置：EGFR外显子19 引物：上游——AAC GTC TTC CTT CTC TCT CTG TCA 下游——CCA CAC AGC AAA GCA GAA ACT 退火温度：57°C 产物长度：150bp 反应液： DNA 4μg（100ng） 10 x 缓冲液5μg 2.5mmol/L dNTP 5μL 上游及下游引物 ( 20mmol/L ) 各1μg Pfu酶（2.5U/μL）1μL(DEPC-H2O补充至 50μL） 为了验证引物的有效性，需要再次打开NCBI，blast设计好的引物的特异性