9.用于核酸杂交的分子探针有DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡 核苷酸探针等多种。 Northern blot技术最合适的探针为cDNA探针。如果选用基因组DNA 探针时,要尽可能使用基因的编码序列(外显子部分)作为探针,而避免使用内含子及其它 非编码序列,否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果 RNA探针因为操作不方便,常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基因点突变分析,但是由 于这类探针分子量小,标记后不容易纯化,往往给实验带来困难。 10.用于核酸杂交的分子探针的标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中, 同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物,因其具有灵敏度高、特异性强、杂 交本底低等优点。而且,其曝光时间可以随意调节,以获得最佳曝光效果:实验结束,膜经 洗脱后可以反复使用多次,这也是其优点 1.探针的同位素标记方法有多种,其中缺口平移法与随机引物法最为常用。采用缺 口平移法标记同位素时,使用的标记物应在脱氧核三磷酸的α-磷酸位上:所使用的 DNase i 浓度一定要适当,过高则导致缺口过多,从而使探针长度过短,过低则不足以形成足量的缺 口,从而使标记效率下降:反应温度一定要控制在14-16℃之间;另外,单链DNA和RNA 不能采用此方法进行标记。随机引物法除能进行双链DNA标记外,也可用于单链DNA和 RNA探针的标记。此法操作方便,标记活性高,因而为多数实验室所采纳。目前已经有许 多种探针标记的试剂盒,可以方便的择用 实验9 RTPCR 实验目的:观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链式反应( RIPCR)以 其灵敏度高,要求样品量少,实验周期短而倍受青睐。有人将 RTPCR实验结果与 Northern blot 结果等进行比较分析,发现两种不同方法所得到的实验结果相一致 类似的有 Northern blot、原位杂交,甚至原位PCR等。 原理 首先,以目的基因mRNA为模板,利用反转录酶的活性,合成对应的cDNA。然后在 模板cDNA、目的基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠 Taq dna聚合酶 的酶促反应,通过变性、退火、延伸的反复循环中,扩增出大量特异的目的DNA产物。最 后,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离,显色,并进行图象分析。 实验准备(略) 实验步骤 1.分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各样品总RNA取5ul加入lm水中测OD值,当OD260/OD28≥1.8时,方可使用。根 据以下公式计算RNA的浓度: 样品总RNA含量(ug/ul)=OD26×稀释倍数x40/1000 2.反转录 dNTP (each 10mM) 5× buffer 4ul DTT(100mM) RNAsin (40U/ul 随机引物(100uM) 组织总RNA 2ug 加水至 65℃5min,快速插入冰水中,冰上加入: RNAsin(40U/uD) lul MMLV反转录酶(200Ud)lul 37℃60min,94℃5min(灭活逆转录酶)。-20℃保存9．用于核酸杂交的分子探针有 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针以及人工合成的寡 核苷酸探针等多种。Northern blot 技术最合适的探针为 cDNA 探针。如果选用基因组 DNA 探针时，要尽可能使用基因的编码序列（外显子部分）作为探针，而避免使用内含子及其它 非编码序列，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。 RNA 探针因为操作不方便，常不被采用。寡核苷酸探针较适合于基因点突变分析，但是由 于这类探针分子量小，标记后不容易纯化，往往给实验带来困难。 10．用于核酸杂交的分子探针的标记物有同位素、生物素、地高辛、荧光素等。其中， 同位素是目前国内外研究中应用最多的一类探针标记物，因其具有灵敏度高、特异性强、杂 交本底低等优点。而且，其曝光时间可以随意调节，以获得最佳曝光效果；实验结束，膜经 洗脱后可以反复使用多次，这也是其优点。 11．探针的同位素标记方法有多种，其中缺口平移法与随机引物法最为常用。采用缺 口平移法标记同位素时，使用的标记物应在脱氧核三磷酸的 α-磷酸位上；所使用的 DNase I 浓度一定要适当，过高则导致缺口过多，从而使探针长度过短，过低则不足以形成足量的缺 口，从而使标记效率下降；反应温度一定要控制在 14-16℃之间；另外，单链 DNA 和 RNA 不能采用此方法进行标记。随机引物法除能进行双链 DNA 标记外，也可用于单链 DNA 和 RNA 探针的标记。此法操作方便，标记活性高，因而为多数实验室所采纳。目前已经有许 多种探针标记的试剂盒，可以方便的择用。 实验 9 RTPCR 实验目的：观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合酶链式反应（RTPCR）以 其灵敏度高，要求样品量少，实验周期短而倍受青睐。有人将RTPCR实验结果与Northern blot 结果等进行比较分析，发现两种不同方法所得到的实验结果相一致。 类似的有 Northern blot、原位杂交，甚至原位 PCR 等。 原 理 首先，以目的基因 mRNA 为模板，利用反转录酶的活性，合成对应的 cDNA。然后在 模板 cDNA、目的基因特异引物和 4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依靠 Taq DNA 聚合酶 的酶促反应，通过变性、退火、延伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的 DNA 产物。最 后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并进行图象分析。 实验准备（略） 实验步骤 1．分光光度计检测 RNA 的浓度与纯度 各样品总 RNA 取 5ul 加入 1ml 水中测 OD 值，当 OD260/OD280≥1.8 时，方可使用。根 据以下公式计算 RNA 的浓度： 样品总 RNA 含量（ug/ul）=OD260×稀释倍数×40/1000 2．反转录 dNTP（each 10mM） 2ul 5×buffer 4ul DTT（100mM） 1ul RNAsin（40U/ul） 1ul 随机引物（100uM） 1ul 组织总 RNA 2ug 加水至 18ul 65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入： RNAsin（40U/ul） 1ul M-MLV 反转录酶（200U/ul）1ul 37℃ 60min，94℃ 5min（灭活逆转录酶）。-20℃保存