取消毒过的蓝吸头,用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头,堵住出口,将混匀的 Sepha G50(中号)移入吸头至满。取1.5 ml Eppendorf管,剪去盖,放入l0ml离心管中。将蓝吸 头插入 Eppendorf管,可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部,以保证吸头尖距1.5m管 底部约1-2厘米。1600×g离心4分钟,弃去1.5ml管中的TE液,再用100uTE液加入小柱 离心,如此反复两次平衡柱子 2)分离 用镊子取出原1.5m管,取一新的1.5ml管放入10m离心管,插上平衡过的小柱。将 标记的探针液,加入小柱,1600Xg离心4分钟,小心取出1.5ml管,将分离的到的探针移 入一标签过的1.5ml管,盖紧盖子。 5.探针变性 将含探针的1.5ml管置于沸水中5分钟变性,迅速移入冰中冷却。 6.杂交 将硝酸纤维素膜在2×SSC中浸湿,以防碎裂,然后放入杂交袋中,四周封口,剪去 角注入10毫升预杂交液,挤去气泡,封口,置此袋于40℃水浴摇床中摇晃预杂交1小时以 上。取出袋,拭干,剪去一角,将变性了的探针加入,挤去气泡,封口。为防止含同位素的 探针泄漏,外再封一杂交袋。置此袋于40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜 7.洗膜 取出袋,拭干,剪去一角,将杂交液注入50m管中,存于4℃冰箱,以备再用。剪去 袋的四周,置此袋于2×SSC0.1%SDS液中,取出膜,晃洗于此液。移膜入新的2×SSC/0.1% SDS液中,于50℃中晃洗半小时,如此重复一次 曝光 取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒,放X光胶片于增感屏上,再放上膜,盖上 盒,将片盒存于-70℃冰箱中。一天后冲片,视显影强弱,缩短或延长曝光时间 实验结果 1.电泳后,凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚地见到18S、28S两条明显的橘红条 带,以及前后不等强度的橘红显色 2.X光胶片上可见杂交带。杂交背景低。 3.如果比较不同样品的话,可能会见到在同一分子量的区域见有曝光深浅不等的杂交 带,为了准确定量,可以借助于激光光密度计扫描分析 注意事项 本方法采用同位素标记,整个实验过程中务须严格遵守同位素操作规则,注意安全 2.实验过程中,由于RNA容易被RNA酶降解,因此,要注意无菌操作,以防RNA 酶污染。 3.硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中,不要被污染与破碎,更不能直接用手拿,而应 用扁平摄子小心摄取 4.在使用虹吸法将RNA转移至硝酸纤维素膜上时,要注意将气泡排除干净,并且用 保鲜膜封好凝胶四周,以免形成短路,使转移失败,这样的事例不少见。 含有RNA的硝酸纤维素膜80℃干燥后,如果实验必须中断,可将硝酸纤维素膜用 保鲜袋包好,保存于-20℃冰箱中 6.如果作某一基因表达的半定量分析,可以同时或分别与内参基因探针杂交,以明确 不同样本的上样量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光密度的比值作为半定量 参数,进行统计分析 7.硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交。洗去探针的方法如下: 把硝酸纤维素膜置于70℃的0.l×SsC0.1%SDS中晃洗20分钟,弃去此液,如此条件 洗3次。通常一张膜可以反复杂交3次以上 8.用于 Northern blot实验中固定RNA的材料主要有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝 酸纤维素膜具有成本低、杂交信号本底较低等优点:同时,也有对结合力不够强、重复使用 的次数不多等缺点。而尼龙膜具结合力强、可反复使用等优点:却有成本高、杂交信号高等 缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用取消毒过的蓝吸头，用小玻璃珠或玻璃纤维放入吸头，堵住出口，将混匀的 Sephadex G50（中号）移入吸头至满。取 1.5ml Eppendorf 管，剪去盖，放入 10ml 离心管中。将蓝吸 头插入 Eppendorf 管，可自制一套圈或用一垫圈套于蓝吸头前部，以保证吸头尖距 1.5ml 管 底部约 1-2 厘米。1600×g 离心 4 分钟，弃去 1.5ml 管中的 TE 液，再用 100ul TE 液加入小柱， 离心，如此反复两次平衡柱子。 2）分离 用镊子取出原 1.5ml 管，取一新的 1.5ml 管放入 10ml 离心管，插上平衡过的小柱。将 标记的探针液，加入小柱，1600×g 离心 4 分钟，小心取出 1.5ml 管，将分离的到的探针移 入一标签过的 1.5ml 管，盖紧盖子。 5．探针变性 将含探针的 1.5ml 管置于沸水中 5 分钟变性，迅速移入冰中冷却。 6．杂交 将硝酸纤维素膜在 2×SSC 中浸湿，以防碎裂，然后放入杂交袋中，四周封口，剪去一 角注入 10 毫升预杂交液，挤去气泡，封口，置此袋于 40℃水浴摇床中摇晃预杂交 1 小时以 上。取出袋，拭干，剪去一角，将变性了的探针加入，挤去气泡，封口。为防止含同位素的 探针泄漏，外再封一杂交袋。置此袋于 40℃水浴摇床中摇晃杂交过夜。 7．洗膜 取出袋，拭干，剪去一角，将杂交液注入 50ml 管中，存于 4℃冰箱，以备再用。剪去 袋的四周，置此袋于 2×SSC/0.1％SDS 液中，取出膜，晃洗于此液。移膜入新的 2×SSC/0.1％ SDS 液中，于 50℃中晃洗半小时，如此重复一次。 8．曝光 取上膜封于杂交袋中。在暗室中打开片盒，放 X 光胶片于增感屏上，再放上膜，盖上 盒，将片盒存于-70℃冰箱中。一天后冲片，视显影强弱，缩短或延长曝光时间。 实验结果 1．电泳后，凝胶在紫外透射反射分析仪上可清楚地见到 18S、28S 两条明显的橘红条 带，以及前后不等强度的橘红显色。 2．X 光胶片上可见杂交带。杂交背景低。 3．如果比较不同样品的话，可能会见到在同一分子量的区域见有曝光深浅不等的杂交 带，为了准确定量，可以借助于激光光密度计扫描分析。 注意事项 1．本方法采用同位素标记，整个实验过程中务须严格遵守同位素操作规则，注意安全。 2．实验过程中，由于 RNA 容易被 RNA 酶降解，因此，要注意无菌操作，以防 RNA 酶污染。 3．硝酸纤维素膜在剪取等操作过程中，不要被污染与破碎，更不能直接用手拿，而应 用扁平摄子小心摄取。 4．在使用虹吸法将 RNA 转移至硝酸纤维素膜上时，要注意将气泡排除干净，并且用 保鲜膜封好凝胶四周，以免形成短路，使转移失败，这样的事例不少见。 5．含有 RNA 的硝酸纤维素膜 80℃干燥后，如果实验必须中断，可将硝酸纤维素膜用 保鲜袋包好，保存于-20℃冰箱中。 6．如果作某一基因表达的半定量分析，可以同时或分别与内参基因探针杂交，以明确 不同样本的上样量是否一致。方法是将目的基因光密度与内参基因光密度的比值作为半定量 参数，进行统计分析。 7．硝酸纤维素膜洗去探针后可用于新探针的杂交。洗去探针的方法如下： 把硝酸纤维素膜置于 70℃的 0.1×SSC/0.1％SDS 中晃洗 20 分钟，弃去此液，如此条件 洗 3 次。通常一张膜可以反复杂交 3 次以上。 8．用于 Northern blot 实验中固定 RNA 的材料主要有硝酸纤维素膜与尼龙膜。其中硝 酸纤维素膜具有成本低、杂交信号本底较低等优点；同时，也有对结合力不够强、重复使用 的次数不多等缺点。而尼龙膜具结合力强、可反复使用等优点；却有成本高、杂交信号高等 缺点。可以根据实验室的具体情况和经验选用