由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点,多年来一直深受广大研究者的喜爱。 其结果可以同时反映某一特定基因RNA分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此 来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的GnRH、N-ras、白蛋 白研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次,蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均 与其生成、代谢有关,而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素,这些变 化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的,所以对 Northern blot的结果要有客观的分析 类似目的的实验主要为 RTPCR 采用变性凝胶电泳,使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理,将RNA 转移至硝酸纤维素膜,烘干,使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针 杂交,杂交后,洗去未被杂交上的探针和游离的同位素,将硝酸纤维素膜放射自显影,使胶 片上出现对应于相应分子量mRNA的条带。最后,对条带进行光密度扫描,并统计分析 实验准备(略) 实验步骤 1.RNA电泳 取 10ug RNa旋转真空干燥,溶于20ul新配的样品缓冲液。置样品于65℃水浴中5分 钟,迅速移入冰中冷却,再加4ul上样缓冲液,混匀。移胶至电泳槽内,注入电泳缓冲液 l×MOPS,浸没凝胶,轻轻拔去疏子。接通电源,负极靠近上样孔。吸取样品24ul,注入上 样孔内。开启电源,电压调至100V。电泳约2小时,至溴酚蓝移至前缘时,关闭电源 轻轻取出凝胶,移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺,拍照 2.RNA转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器,注入20xSSC,容器上缘架一水平玻璃板。取2-4层滤纸,纸宽同凝 胶长,纸长足以经玻璃板两侧浸入20×SSC中。待滤纸全都湿透后,滚动移液管赶走滤纸间 及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分,在凝胶第一上样孔处切去一小角,作 为记号,把凝胶底朝上放于滤纸上,用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁 成凝胶大小,对应凝胶剪去一小角,先浸湿于双蒸水中,再浸于20×SSC中,取出平放于凝 胶之上,缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置 2-4层20×SSC浸湿的滤纸,用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡 用4张保鲜膜沿凝胶4侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器,以防止凝胶外形成虹吸短 路,以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方,铺4-6厘米厚的卫生纸,上置一平玻板, 玻板上压一300-500克的重物。过夜。 次日上午,取出凝胶与硝酸纤维素膜,在投射紫外灯仪上确认RNA已全部转移至硝酸 纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间,在80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。 3.探针标记(此工作与膜转移于同一天进行。) 水 14 uI 5 ul BSA( 10mg/ml I ul DNA( 30-50 ng 00℃×5min,37℃xl0min,4℃x5min a[-PldcTP (50uCi) 2.5ul 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5ul 混匀,4℃过夜,次日再加 大肠杆菌聚合酶K片段 0.5ul 半小时后加入终止液 4.离心柱分离探针 1)柱的制备由于此方法具有稳定、可靠、假阳性少等特点，多年来一直深受广大研究者的喜爱。 其结果可以同时反映某一特定基因 RNA 分子量的大小及其数量。在中医药实验中通常以此 来判别某一中医药方法对某一已知基因转录的调控作用。例如我们的 GnRH、N-ras、白蛋 白研究。 通常观察某一分子的变化有两个层次，蛋白水平的和核酸水平的。两者的含量变化均 与其生成、代谢有关，而两者的作用发挥还关系到其质量、修饰、环境条件等因素，这些变 化采用观察蛋白与核酸的量是不能回答的，所以对 Northern blot 的结果要有客观的分析。 类似目的的实验主要为 RTPCR。 原 理 采用变性凝胶电泳，使 RNA 分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将 RNA 转移至硝酸纤维素膜，烘干，使 RNA 牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针 杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，将硝酸纤维素膜放射自显影，使胶 片上出现对应于相应分子量 mRNA 的条带。最后，对条带进行光密度扫描，并统计分析。 实验准备（略） 实验步骤 1．RNA 电泳 取 10ug RNA 旋转真空干燥，溶于 20ul 新配的样品缓冲液。置样品于 65℃水浴中 5 分 钟，迅速移入冰中冷却，再加 4ul 上样缓冲液，混匀。移胶至电泳槽内，注入电泳缓冲液 1×MOPS，浸没凝胶，轻轻拔去疏子。接通电源，负极靠近上样孔。吸取样品 24ul，注入上 样孔内。开启电源，电压调至 100V。电泳约 2 小时，至溴酚蓝移至前缘时，关闭电源。 轻轻取出凝胶，移至紫外透射反射分析仪上检查电泳结果。在凝胶一侧放把尺，拍照。 2．RNA 转移至硝酸纤维素膜 取一洁净的容器，注入 20×SSC，容器上缘架一水平玻璃板。取 2-4 层滤纸，纸宽同凝 胶长，纸长足以经玻璃板两侧浸入 20×SSC 中。待滤纸全都湿透后，滚动移液管赶走滤纸间 及其与玻璃板间的气泡。切去凝胶上样孔及以上部分，在凝胶第一上样孔处切去一小角，作 为记号，把凝胶底朝上放于滤纸上，用移液管赶走凝胶与滤纸间的气泡。把硝酸纤维素膜裁 成凝胶大小，对应凝胶剪去一小角，先浸湿于双蒸水中，再浸于 20×SSC 中，取出平放于凝 胶之上，缺角处与凝胶缺角处对齐。用移液管赶走凝胶与硝酸纤维素膜间的气泡。膜上置 2-4 层 20×SSC 浸湿的滤纸，用移液管赶走滤纸与硝酸纤维素膜间的气泡。 用 4 张保鲜膜沿凝胶 4 侧盖住凝胶旁的滤纸、玻璃和容器，以防止凝胶外形成虹吸短 路，以及容器内的缓冲液干燥。在胶上滤纸之上方，铺 4-6 厘米厚的卫生纸，上置一平玻板， 玻板上压一 300-500 克的重物。过夜。 次日上午，取出凝胶与硝酸纤维素膜，在投射紫外灯仪上确认 RNA 已全部转移至硝酸 纤维素膜上。把该膜夹于两张洁净的滤纸间，在 80℃真空干燥箱中真空干燥两小时。 3．探针标记（此工作与膜转移于同一天进行。） 水 14 ul OLB 5 ul BSA （ 10mg/ml ） 1 ul DNA （ 30-50 ng ） 2 ul 100℃×5min, 37℃×10min, 4℃×5min α[32P]dCTP （50uCi） 2.5 ul 大肠杆菌聚合酶 K 片段 0.5 ul 混匀，4℃ 过夜，次日再加 大肠杆菌聚合酶 K 片段 0.5 ul 半小时后加入终止液 50 ul 4．离心柱分离探针 1）柱的制备