。298 北京科技大学学报 第31卷 存活的细菌主要为杆菌，大小为(0.4~0.6)m× 优势菌的PCR产物序列与Leptospirillum fer- (0.9~1.9)m:而15℃下的细菌为螺旋菌，大小为 iphilum的相似值为99.2%.30C浸出体系样品中 (0.3-0.5)m×(0.9~25)m. 优势菌的PCR产物序列与Acidithiobacil lus thioox- 23.2不同温度下菌群的组成 idas相似值为99.8%：两个样品中均存在同一种 分子生物学技术用于微生物生态学研究中能够 生长劣势菌，其PCR产物序列与Acidithiobacillus 快速有效地分析群落中微生物的组成，它可以避免 cald的相似值为99.5%.虽然浸出起始时15℃ 传统分离培养中筛选作用所造成的微生物多样性丢 和30℃的细菌相同，但是在15℃时，已经不是上述 失问题，而且能够直接可靠地反映生态系统中微生 三种菌的最佳生长温度，由于Leptospirillum fer- 物多样性及种群分布情况习.本文采用微生物生态 riphilum能够耐受较低的温度，仍能氧化Fe2+,所 学中常用的一种分子生物学技术DGGE对浸出液 以在15℃成为优势菌，在30℃时Acidithiobacillus 中的微生物组成进行分析，通过DGGE技术可以将 thiooxidans成为优势菌. PCR扩增到的同样长度但具有不同序列的DNA片 断分离. 3结论 国外已有将该技术应用于浸矿体系微生物种群 从福建紫金山金铜矿硫化铜矿生物堆浸矿堆中 研究的相关报道1：山，但国内在这方面的研究很 分离到的浸矿微生物最佳的生长温度为30℃.在 少.本文利用PCR-DGGE技术对不同温度下的浸 此温度下具有较高的浸矿旷性能.紫金山金铜矿硫化 矿体系中微生物种群组成进行了分析.通过PCR 铜矿石浸出10d,铜浸出率为87.62%，在相同的浸 扩增后得到大约6O0bp(base pair,碱基对)的扩增 出时间内高于30℃或低于30℃铜浸出率都要降 产物，将两个样品的PCR扩增产物进行DGGE分 低.通过比较15℃和30℃的下细菌的形貌发现， 析，使得不同序列的片段得以分离.结果表明，两个 15℃下存活的细菌为螺旋菌，30℃下的细菌为杆 样品中均有两个条带得以分离.根据“DGGE条带 菌.进一步的分子生物学分析表明，15℃浸出体系 数代表微生物种类丰度，条带亮度代表种群的优劣 样品中优势菌为Leptospirillum ferriphilum,30℃ 势”的原理，可以判断两个样品中至少均含有两种不 浸出体系样品中优势菌为Acidithiobacillus thiooxi- 同的微生物，其中一种微生物为优势菌。对分离开 das两个样品中均存在同一种生长劣势菌 的条带切胶回收，以回收到的片段为模板，以358F Acidithiobacillus caldus.优势菌种随温度的变化是 和907R为引物，对片段进行二次扩增，得到大量的 与菌种的性质相关的. PCR扩增产物，见图3，其中()是30C样品的产 物，(b)是15℃样品的产物. 参考文献 [I]Ehrlich H L.Past.present and future of biohydmometallurgy. (b) Hydrometallurgy.2001.59(2/3):127 [2 Raw lings D E,Dew D.Chris D.Biomineralization of metacon- tairing ores and concentrates.Trends Bidechnd.2003,21(1): 38 3 Sand W,Gehrke T,Jozsa P G,et al Bio)chemistry of bacterial leaching drect vs.indirec bioleaching.Hydrometallurgy. 2001,592/3):159 [4 Raw lings D E.Characteristics and adaptalility of iron and sulfur- oxidizing micmorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates.Micb Cell Fact.2005.4(1): 13 [5 Brierky C L.Bacteria succession in hioheap leaching.Hydromet- allurgy,2001,59(2y3):249 图3PCR二次扩增产物的电泳照片.(30℃(b)15℃ [6 Oved T.Shaviv A.Goldrath T.et al.Influence of effluent irri- Fig.3 Electmophoresis pictures of secondary PCR amplification gation on community com position and function of ammonia-oxidz pmoducts:(a)30 C:(b)15 C ing bacteria in soil.Appl En viron Microbiol,2001,67(8):3426 [7 Demergasso C S,Galleguilbs P,Escudero G,et al.Molecular 扩增产物测序后，将所得序列在NCBL网站上 characterization of micmobial populations in a low-grade copper ore 的Blast软件比较.结果显示：15℃浸出体系样品中 bioleaching test heap.Hydrometallurgy.2005.80(4):241存活的细菌主要为杆菌, 大小为( 0.4 ～ 0.6) μm × ( 0.9 ～ 1.9) μm ;而 15 ℃下的细菌为螺旋菌, 大小为 ( 0.3 ～ 0.5) μm ×( 0.9 ～ 2.5) μm . 2.3.2 不同温度下菌群的组成 分子生物学技术用于微生物生态学研究中能够 快速有效地分析群落中微生物的组成, 它可以避免 传统分离培养中筛选作用所造成的微生物多样性丢 失问题, 而且能够直接可靠地反映生态系统中微生 物多样性及种群分布情况[ 9] .本文采用微生物生态 学中常用的一种分子生物学技术 DGGE 对浸出液 中的微生物组成进行分析, 通过 DGGE 技术可以将 PCR 扩增到的同样长度但具有不同序列的 DNA 片 断分离. 国外已有将该技术应用于浸矿体系微生物种群 研究的相关报道[ 10-11] , 但国内在这方面的研究很 少.本文利用 PCR-DGGE 技术对不同温度下的浸 矿体系中微生物种群组成进行了分析 .通过 PCR 扩增后得到大约 600 bp( base pair, 碱基对) 的扩增 产物, 将两个样品的 PCR 扩增产物进行 DGGE 分 析, 使得不同序列的片段得以分离 .结果表明, 两个 样品中均有两个条带得以分离 .根据“DGGE 条带 数代表微生物种类丰度, 条带亮度代表种群的优劣 势”的原理, 可以判断两个样品中至少均含有两种不 同的微生物, 其中一种微生物为优势菌.对分离开 的条带切胶回收, 以回收到的片段为模板, 以 358F 和 907R 为引物, 对片段进行二次扩增, 得到大量的 PCR 扩增产物, 见图 3, 其中( a) 是 30 ℃样品的产 物, ( b) 是 15 ℃样品的产物. 图 3 PC R 二次扩增产物的电泳照片.( a) 30 ℃;(b) 15 ℃ Fig.3 Electrophoresis pictures of secondary PC R amplification products:( a) 30 ℃;( b) 15 ℃ 扩增产物测序后, 将所得序列在 NCBI 网站上 的 Blast 软件比较.结果显示 :15 ℃浸出体系样品中 优势 菌的 PCR 产物 序列与 Leptospirillum fer￾riphilum 的相似值为 99.2 %, 30 ℃浸出体系样品中 优势菌的PCR 产物序列与 Acidithiobacillus thioox￾idans 相似值为 99.8 %;两个样品中均存在同一种 生长劣势菌, 其 PCR 产物序列与 Acidithiobacillus caldus 的相似值为 99.5 %.虽然浸出起始时 15 ℃ 和 30 ℃的细菌相同, 但是在 15 ℃时, 已经不是上述 三种菌的最佳生长温度, 由于 Leptospirillum fer￾riphilum 能够耐受较低的温度, 仍能氧化 Fe 2 + , 所 以在 15 ℃成为优势菌, 在 30 ℃时 Acidithiobacillus thiooxidans 成为优势菌 . 3 结论 从福建紫金山金铜矿硫化铜矿生物堆浸矿堆中 分离到的浸矿微生物最佳的生长温度为 30 ℃.在 此温度下具有较高的浸矿性能.紫金山金铜矿硫化 铜矿石浸出 10 d, 铜浸出率为 87.62 %, 在相同的浸 出时间内高于 30 ℃或低于 30 ℃铜浸出率都要降 低 .通过比较 15 ℃和 30 ℃的下细菌的形貌发现, 15 ℃下存活的细菌为螺旋菌, 30 ℃下的细菌为杆 菌 .进一步的分子生物学分析表明, 15 ℃浸出体系 样品中优势菌为 Leptospirillum ferriphilum, 30 ℃ 浸出体系样品中优势菌为 Acidithiobacillus thiooxi￾dans, 两 个 样品 中 均 存 在 同 一 种 生 长 劣 势 菌 Acidithiobacillus caldus .优势菌种随温度的变化是 与菌种的性质相关的. 参 考 文 献 [ 1] Ehrlich H L .Past, present and future of biohydrometallurgy . Hydrometallurgy, 2001, 59( 2/ 3) :127 [ 2] Raw lings D E, Dew D, Chris D .Biomineralization of met al-con￾taining ores and concentrates.Trends Biot echnol, 2003, 21 ( 1 ) : 38 [ 3] Sand W, Gehrke T, Jozsa P G, et al.( Bio) chemistry of bacterial leaching:direct vs.indirect bioleaching. Hydrometallurgy , 2001, 59( 2/ 3) :159 [ 4] Raw lings D E .Characteristics and adaptability of iron and sulfur￾oxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrat es.Mi crob Cell Fact, 2005, 4( 1 ) : 13 [ 5] Brierley C L.Bacteria successi on in bioheap leaching .Hydromet￾allurgy, 2001, 59( 2/ 3) :249 [ 6] Oved T, Shaviv A, Goldrath T, et al.Influence of effluent irri￾gation on community com position and function of ammonia-oxidiz￾ing bacteria in soil.Appl En viron Microbiol, 2001, 67( 8) :3426 [ 7] Demergasso C S, Galleguillos P, Escudero G, et al.Molecular characterization of microbial populations in a low-grade copper ore bioleaching test heap.Hydrometa llurgy, 2005, 80( 4) :241 · 298 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 31 卷