但目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小,如下丘脑、松果体、细 胞膜或内膜等原材料,因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目 的定。一般要注意种属的关系,事前调查制备的难易情况 、蛋白质的分离 (一)细胞的破碎 细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不 能立即进行实验,则应冷冻保存。除了提取细胞外成分,对细胞内及多细胞生 物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不 同生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破坏难易不一,使用方法也不完全 相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,作普通匀浆器磨研即可,肌肉及心 组织较韧,需预先绞碎再制成匀桨。 1.机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:① 高速组织捣碎机(转速可达10000pm,具高速转动的锋利的刀片),宜用于动 物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器(用两个磨砂面相互摩擦,将细胞磨碎),适 用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等。小量的也可用乳钵与适当的缓冲 剂磨碎提取,也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热 导致变性或pH显著变化,尤其用玻璃粉和氧化铝时。此外,磨细剂的吸附也 可导致损失 2.物理方法主要通过各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法。① 反复冻融法:于冷藏库或干冰反复于零下15~20℃使之冻固,然后缓慢地融解, 如此反复操作,使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化,使结合 水冻结产生组织的变性,冰片将细胞膜破碎,使蛋白质可溶化,成为粘稠的浓 溶液,但脂蛋白冻结变性;②冷热变替法:将材料投入沸水中,于9℃左右维 持数min,立即置于冰浴中使之迅速冷却,绝大部分细胞被破坏;③超声波法: 暴露于9~10千兆声波或10~500千兆超声波所产生的机械振动,只要有设备 该法方便且效果也好,但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液 中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重;④加压破碎法:加 定气压或水压也可使细胞破碎 3.化学及生物化学方法这类方法包括①有机溶媒法:粉碎后的新鲜材料 在0℃以下加入5~10倍量的丙酮,迅速搅拌均匀,可破碎细胞膜,破坏蛋白质但目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细 胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目 的定。一般要注意种属的关系，事前调查制备的难易情况。 二、蛋白质的分离 （一）细胞的破碎 细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不 能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取细胞外成分，对细胞内及多细胞生 物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不 同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全 相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心 组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 1. 机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：① 高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动 物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适 用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等。小量的也可用乳钵与适当的缓冲 剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热 导致变性或pH 显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。此外，磨细剂的吸附也 可导致损失。 2. 物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。① 反复冻融法：于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解， 如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合 水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓 溶液，但脂蛋白冻结变性；②冷热变替法：将材料投入沸水中，于90℃左右维 持数min，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏；③超声波法： 暴露于9～10 千兆声波或10～500 千兆超声波所产生的机械振动，只要有设备 该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液 中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重；④加压破碎法：加 一定气压或水压也可使细胞破碎。 3. 化学及生物化学方法 这类方法包括①有机溶媒法：粉碎后的新鲜材料 在 0℃以下加入 5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质