第四节溶酶体的分离 溶酶体是由一层单位膜包围,内含多种酸性水解酶的泡状结构。溶酶体含有 40多种水解酶,其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶等。其主要功能是对细 胞内物质的消化作用。此外溶酶体与器官形成、激素分泌的调节以及某些疾病的 发生密切相关。可采用如下方法分离获得。 1制备蔗糖梯度溶液:取带有两个小杯的梯度混合器,两个小杯分别装入 l17m2.lmoL蔗糖和13mll.lmoL的蔗糖; 2将大鼠处死取出肾脏,以1:8(重量/体积)比例加入0.3mol/L蔗糖,然后 在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织 3以150g×10min离心,弃沉淀,取上清液,900g×3min离心,弃上清液, 取沉淀; 4沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层,上层为膜成 分的混合物,中层为线粒体部分,最底层则为半纯化的溶酶体。先用吸管小心吸 掉上层,然后沿管壁加入几毫升0.3mol冮L蔗糖,慢慢摇管使界面层悬浮起来弃 之。用0.3molL蔗糖洗涤1次,底层溶酶体部分悬浮在2.5m0.3mol/蔗糖中; 5将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面,用玻璃棒搅动最上层的梯度 使梯度和溶酶体之间的界面破坏,然后10000150min离心,离心结果可见 梯度溶液分3条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的 溶酶体。以上所有操作需在0~4℃下进行 第五节细胞总蛋白质的分离提取 细胞器是一种动态的结构,如内质网、细胞核和高尔基体等,其蛋白质组成 除了驻留蛋白质之外,还包括穿梭蛋白质和瞬间相互作用的蛋白质。对于这些组 成成分的硏究,即亚细胞蛋白质组研究将有助于对这些蛋白质做全面的挖掘,从 而对细胞器的功能作深入的阐述。蛋白质提取与制备具体操作方法如下: 、材料的选择 早年为了研究的方便,尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。第四节 溶酶体的分离 溶酶体是由一层单位膜包围，内含多种酸性水解酶的泡状结构。溶酶体含有 40 多种水解酶，其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶等。其主要功能是对细 胞内物质的消化作用。此外溶酶体与器官形成、激素分泌的调节以及某些疾病的 发生密切相关。可采用如下方法分离获得。 1.制备蔗糖梯度溶液：取带有两个小杯的梯度混合器，两个小杯分别装入 117ml 2.1mol/L 蔗糖和 13ml 1.1mol/L 的蔗糖； 2.将大鼠处死取出肾脏，以 1:8（重量/体积）比例加入 0.3mol/L 蔗糖，然后 在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织； 3.以 150g ×10min 离心，弃沉淀，取上清液，9000g×3min 离心，弃上清液， 取沉淀； 4.沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层，上层为膜成 分的混合物，中层为线粒体部分，最底层则为半纯化的溶酶体。先用吸管小心吸 掉上层，然后沿管壁加入几毫升 0.3mol/L 蔗糖，慢慢摇管使界面层悬浮起来弃 之。用 0.3mol/L 蔗糖洗涤 1 次，底层溶酶体部分悬浮在 2.5ml 0.3mol/L 蔗糖中； 5.将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面，用玻璃棒搅动最上层的梯度， 使梯度和溶酶体之间的界面破坏，然后 100000g×150min 离心，离心结果可见： 梯度溶液分 3 条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的 溶酶体。以上所有操作需在 0~4℃下进行。 第五节 细胞总蛋白质的分离提取 细胞器是一种动态的结构，如内质网、细胞核和高尔基体等，其蛋白质组成 除了驻留蛋白质之外，还包括穿梭蛋白质和瞬间相互作用的蛋白质。对于这些组 成成分的研究，即亚细胞蛋白质组研究将有助于对这些蛋白质做全面的挖掘，从 而对细胞器的功能作深入的阐述。蛋白质提取与制备具体操作方法如下： 一、材料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质