36 自然科学进展—一国家重点实验室通讯 第5卷 Ra)、柚子( Citrus grandis Swingle)一直未能得到胚性愈伤组织 获得胚性愈伤组织的另一条途径是从败育的种子中诱导.甘霖等通过这一途径获得了 几个柑桔品种的胚性愈伤组织9.邓秀新等从山金柑( Fortunella hindsii Swingle)试管实生苗 的下胚轴及根部直接获得了胚性愈伤组织0成熟的山金柑种子播种在MT基本培养基中 50d后,有16.7%的幼苗从子叶下0.1~20cm处产生愈伤组织.甚至将子叶下0.5cm处的组 织培养在MT基本培养基上,385%的外植体产生了胚性愈伤组织.这一简易获得胚性愈伤组 织的途径在金柑属的其它种以及柑桔属的一些种均得到证实,只是品种(种)不同,产生的频 率有差异.个别品种,如“脐橙’败育胚珠容易诱导胚状体,而不易获得能继代的胚性愈伤组 织,叶新荣等在培养基中加入AgNO35mg/L,以抑制乙烯产生,获得了该品种的胚性愈伤组 织.通过以上各类途径获得的柑桔类愈伤组织在无外源激素的MT培养基中均能继代保 存,并保持较好的胚胎发生能力.如今,实验室有近20个柑桔种(品种)的胚性愈伤组织,为 以柑桔愈伤组织进行的各类研究提供了方便 不同品种胚性愈伤组织的胚胎发生能力有较大差异.各个品种的愈伤组织的干物质含 量,可溶性蛋白质含量以及脱氢酶活性均与其胚胎发生能力呈正相关.带桔的胚性愈 伤组织干物质含量如果低于10.0%,则再生能力很弱.一般的柑桔胚生愈伤组织干物质含量在 10.0%以上.对胚性愈伤组织胚胎发生的控制一喜足研究的热点. Be1)-ndyyin等1983年发现 以甘油取代培养基中的蔗糖促进了舡伤组织向胚状体方向友展,进一步的研究还发现, 甘油1%~5%取代蔗糖后,虽然促进了胚状体的再生,但对胚状体后期的发育并不有利13.14 由此产生的胚状体在添加麦芽浸出物1500mg/L或硫酸腺嘌呤5mg/L的MT培养基中可进一 步发育,减少畸形压状体比例214 2原生质体培养再生成植株1 柑桔原生质体培养技术首先由vad等报道.16.本研究以我国主栽甜橙( Citrus sinensis Osbeck)品种‘锦橙'胚性愈伤组织为起始材料.采用0.3%的果胶酶和0.3%的纤维素酶离 析愈伤组织,获得原生质体.原生质体经浅层培养方式,在无外源激素的MT基本培养基 中,7d时有4%的细胞恢复分裂.采用低熔点琼脂糖包埋(半固化)可使恢复分裂的原生质 体比例进一步提高到50%.经双层培养,扩大培养面,细胞团可以再生出胚状体.转入摇 床悬浮培养,因改善了培养条件胚状体再生整齐一致,而且再生成植株的时间比固体培养缩 短了1~2个月2.再生植株移栽过程中,适当降低温度至25℃,能有效地减少试管苗的萎 蔫,提高移栽成活率达90%以上12.邓占鏊等利用已建立起的柑桔原生质体再生体系,从 锦橙’桃叶橙'耐盐突变系分离原生质体,经培养再生成植株.耐盐系原生质体在盐“胁 迫”下,存活率和生长都正常,说明耐盐系是稳定的,耐盐系积累较多的脯氨酸,持较高水 平的K+,而吸收较少的C和Na+1.本研究在建立再生体系时,已获得9个种(品种) 的原生质体再生植株(表1) 3原生质体融合与体细胞杂种再生 31已获得的体细胞杂种 Ogawara及 Grosser等应用原生质体融合技术获得了柑桔属间体细胞杂种19-24,这 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net自然科学进展 — 国家重 点实验室通 讯 第 卷 、 袖 子 , 、 诚 一 直未能得 到胚性愈 伤组织 获得胚性 愈伤组织 的另 一条途径是从败育 的种子 中诱 导 甘霖等通过 这一 途 径 获得 了 几个柑桔 品种 的胚性愈伤组织 邓 秀新等从 山金 柑 试管实生 苗 的下 胚轴及根部 直接获得 了胚性愈伤组织 ‘ 成熟 的 山金柑 种子播种在 基本培养 基 中 , 后 , 有 的幼 苗从子 叶下 一 处产生愈伤组织 甚至将子叶下 处的组 织培养在 基本培 养基上 , 的外植体产生 了胚性愈伤组织 这一简易获得胚性愈伤组 织 的途径在 金柑 属 的其它种 以 及柑 桔 属 的一些 种均 得 到证实 , 只 是 品种 种 不同 , 产生的频 率有差异 个别 品种 , 如 ‘ 脐橙 ’ 败育胚珠容 易诱 导胚状体 , 而 不易获得能继代 的胚性愈伤组 织 叶新 荣等在培 养基 中加 人 , 以 抑制 乙 烯产 生 , 获得 了该品种的胚性愈伤组 织 通过 以上 各类 途 径获得 的柑桔 类 愈 伤组 织 在 无 外 源激 素 的 培 养 基 中均 能 继 代 保 存 , 并保持较好的胚胎发生能力 如今 , 实验 室有 近 个柑桔 种 品种 的胚性 愈伤组织 , 为 以柑桔 愈伤组织进行 的各类研究提供 了方便 不 同品种胚性 愈伤组织 的胚胎发 生 能力有 较 大 差 异 各 个 品 种 的 愈 伤组 织 的 干物 质含 量 , 可溶性蛋 白质含量 ” 以及 脱氢酶 括性 均 与其 胚 胎 发 生 能 力 呈 正 相 关 柑 桔 的 胚 性 愈 伤组织 干物质含 量 如果低于 , 则 再 生能力很弱 一般的柑桔胚性愈伤组织干物质含量在 以 上 对胚性愈 伤组 织胚胎 发生 的控制一直是研究 的热点 一 等 年发现 以 甘 油取 代 培 养 基 中 的 蔗 糖 促 进 了 愈 伤 组 织 向胚 状 体方 向发 展 , 进 一 步 的研 究 还 发现 , 甘油 一 取代蔗糖后 , 虽然促 进 了胚状体的再生 , 但对胚状体后期的发育并不有利“ , ‘ 由此 产生 的胚状体在添加 麦芽浸出物 或硫酸腺嗓 吟 的 培养基 中可 进一 步 发育 , 减 少畸形胚状体 比例 , , 原 生质体培养再生成植株 ‘, ’ 柑 桔 原生质体培 养技术首先 由 等报道 , ’“ 本研究 以 我 国主栽甜橙 。 品种 ‘ 锦橙 ’ 胚性 愈伤组织 为起 始材 料 采 用 的果 胶 酶 和 的纤 维 素酶 离 析愈伤组织 , 获得原 生质体 原生质体经 浅层 培 养 方 式 , 在 无 外 源 激 素 的 基 本 培 养基 中 , 时有 的细胞恢复分 裂 采用低 熔 点琼脂糖包埋 半 固化 可 使恢 复分裂 的原生 质 体 比例进一步提 高到 经双层培 养 , 扩大 培 养 面 , 细 胞 团 可 以 再 生 出胚 状 体 转人 摇 床悬 浮培 养 , 因改善 了培 养条件胚状体再 生整 齐一致 , 而且再 生成 植株 的时 间 比固体培养缩 短 了 一 个月【’ 再 生 植株移栽过程 中 , 适 当降低温度 至 ℃ , 能有 效地 减少试管苗的萎 蔫 , 提 高移栽成 活 率达 以 上【‘ 邓 占鳌等利 用 已 建 立起 的柑桔 原 生 质 体 再 生 体 系 , 从 ‘ 锦橙 ’ 、 ‘ 桃 叶橙 ’耐盐突变 系分 离原生 质体 , 经培养再生成植株 耐 盐 系 原 生 质 体在 盐 “ 胁 迫 ” 下 , 存活率和 生长都正 常 , 说明耐盐 系是稳定 的 , 耐盐系积累较多 的脯 氨 酸 , 持较高水 平 的 , 而 吸收较少 的 一 和 ’, ’ 本研究 在 建 立 再 生 体 系 时 , 已 获 得 个 种 品种 的原 生质体再生 植株 表 原生质体融合与体细胞杂种再生 已获得的体细胞杂种 及 等应 用原生质 体融 合技 术 获得 了柑桔 属 间体细胞杂种【‘”一 ’ 这 一