【方法】 1.细菌的培养和收集(同煮沸法)。 2.裂解细菌 (1)无菌操作台上,取1.5m培养菌体置于离心管( Eppendorf管)中,微 量离心机上以4℃,10000pm离心1min,或者以4000pm离心5-10min,弃上 清液,离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。 (2)沉淀中加100u山用冰预冷的溶液I,加或不加入少量溶菌酶粉末,充分 混合(需要剧烈振荡)。室温下放置10mins (3)加入200u溶液Ⅱ(新鲜配置),加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀 (千万不要振荡),冰浴5min (4)加入150山预冷溶液II,轻轻颠倒数次混匀(10s),置于冰浴15min 微量离心机上以4℃,1200opm离心l5mi,取上清液于另一新 Eppendorf管中 (5)上清液中加入等体积酚氯仿(1:1)混匀,微量离心机上以4℃,12000pm 离心5min。如果选用宿主合适的话(如DH5a、XL1-blue等,HBl01和BL21 则不行),可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇沉淀,沉淀中所含的 盐和RNA就很少了,完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒,后续的限 制性酶切转化完全没有问题。小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下 层的有机相。 (6)小心移出上液于一新 Eppendorf管中,加入2/3倍体积异丙醇,混匀 4℃离心12000g离心5min。 (7)上清液中加入2倍体积的无水乙醇混匀,室温下放置5~10min,以 000pm,离心5~15min。 (8)lonl预冷的π0%乙醇洗涤沉淀1~2次,沉淀在室温下晾干。小心吸 去上清液,将离心管倒置于一张纸上,使所有的液体流出。再将附着在管壁上的 液滴除去。在除去管壁上的液滴时,可以用一次性吸头与真空管相连,用吸头接 触液面。但在液体吸岀时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干 到看不到液滴最好。 (9)加入50uT缓冲液(pH8020μg/ mI rnasea)溶解质粒粗提物,在-20℃ 保存。 3.分离和纯化质粒DNA(同煮沸法) 【注意事项】【方法】 1. 细菌的培养和收集（同煮沸法）。 2. 裂解细菌 （1）无菌操作台上，取 1.5ml 培养菌体置于离心管（Eppendorf 管）中，微 量离心机上以 4℃，10000rpm 离心 1min，或者以 4000rpm 离心 5~10min，弃上 清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。 （2）沉淀中加 100μl 用冰预冷的溶液 I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分 混合（需要剧烈振荡）。室温下放置 10min。 （3）加入 200μl 溶液 II（新鲜配置），加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀 （千万不要振荡），冰浴 5min 。 （4）加入 150μl 预冷溶液 III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴 15min 。 微量离心机上以 4℃，12 000rpm 离心 15min，取上清液于另一新 Eppendorf 管中。 （5）上清液中加入等体积酚/氯仿（1:1）混匀，微量离心机上以 4℃，12000rpm, 离心 5min。如果选用宿主合适的话（如 DH5a、XL1-blue 等，HB101 和 BL21 则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用 1 倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的 盐和 RNA 就很少了，完全去除上清液后就可以直接加 TE 溶解质粒，后续的限 制性酶切转化完全没有问题。小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下 层的有机相。 （6）小心移出上液于一新 Eppendorf 管中，加入 2/3 倍体积异丙醇，混匀， 4℃离心 12000g 离心 5min。 （7）上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置 5~10min，以 12 000rpm，离心 5~15min。 （8）1.0ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 1~2 次，沉淀在室温下晾干。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的 液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接 触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干 到看不到液滴最好。 （9）加入 50μl TE 缓冲液（pH8.0 20μg/ml RNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃ 保存。 3. 分离和纯化质粒 DNA（同煮沸法）。 【注意事项】