实验技术 常用细菌培养基制备 感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定,人工培养法为细菌提供必 要的生长条件,使其在体外生长繁殖。本章着重介绍常用细菌培养基的制备、细 菌的接种方法及生化反应鉴定法,最后简介了内毒素的检测。要求同学们了解培 养基的制作原则和方法,掌握细菌的分离培养技术 培养基是指在人工培养细菌时,提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制 品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源 和无杋盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分(如糖类、血液、抑制剂 等)则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等 (一)肉汤培养基 肉汤培养基是常用的液体培养基,也是制备常用的细菌分离培养基及其他某些培 养基的基础 【材料】 鲜牛肉(去脂肪和肌腱)、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10%碳酸氢钠、试管 角烧瓶、蒸馏水等。 【方法】 1.将新鲜牛肉500g切碎或搅碎,加水100mn,放4℃冰箱或冷处浸泡过夜,然 后煮沸30min,放凉,使残余的脂肪凝固,再用绒布或滤纸过滤,将滤液补足为 原量。此溶液称为肉水或肉浸液 2.1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化钠5g,加热溶解,放凉。 3.用精密pH试纸测酸碱度,用10%碳酸氢钠校正p为72左右。过碱时,可 用10%醋酸校正之。 4.分装于试管中或三角烧瓶中,15磅(121℃高压蒸气灭菌20~30min 如用市售的牛肉膏代替新鲜肉水时,可将牛肉膏溶成0.3~0.5%的水溶液,再如 上法制成培养基 (二)普通琼脂培养基 普通琼脂培养基是常用的固体培养基,包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种, 前者用于分离纯种细菌,后者用于增殖纯种细菌或保存菌种 【材料】 ①肉水200ml
实验技术 一、常用细菌培养基制备 感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定，人工培养法为细菌提供必 要的生长条件，使其在体外生长繁殖。本章着重介绍常用细菌培养基的制备、细 菌的接种方法及生化反应鉴定法，最后简介了内毒素的检测。要求同学们了解培 养基的制作原则和方法，掌握细菌的分离培养技术。 培养基是指在人工培养细菌时，提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制 品。基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源 和无机盐等。在基础培养基的基础上添加一些特殊成分（如糖类、血液、抑制剂 等）则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等。 (一)肉汤培养基 肉汤培养基是常用的液体培养基，也是制备常用的细菌分离培养基及其他某些培 养基的基础。 【材料】 鲜牛肉(去脂肪和肌腱)、蛋白胨、氯化钠、pH 试纸、10％碳酸氢钠、试管、三 角烧瓶、蒸馏水等。 【方法】 1．将新鲜牛肉 500g 切碎或搅碎，加水 1000ml，放 4℃冰箱或冷处浸泡过夜，然 后煮沸 30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为 原量。此溶液称为肉水或肉浸液。 2．1000ml 肉水中加入蛋白胨 10g、氯化钠 5g，加热溶解，放凉。 3．用精密 pH 试纸测酸碱度，用 10％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2 左右。过碱时，可 用 10％醋酸校正之。 4．分装于试管中或三角烧瓶中，15 磅(121℃)高压蒸气灭菌 20～30min。 如用市售的牛肉膏代替新鲜肉水时，可将牛肉膏溶成 0.3～0.5％的水溶液，再如 上法制成培养基。 (二)普通琼脂培养基 普通琼脂培养基是常用的固体培养基，包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种， 前者用于分离纯种细菌，后者用于增殖纯种细菌或保存菌种。 【材料】 ① 肉水 200ml
②蛋白胨2g ③氯化钠1g ④琼脂 ⑤无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等 【方法】 1.按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中,加热溶化。 2.趁热用pH试纸测酸碱度,用10%碳酸氢钠校正pH为72左右 3.15磅高压蒸气灭菌20~30min 4.趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内,每个平皿倒入约15m,凝固后即成普 通琼脂平板培养基;如趁热将培养基倒入灭菌试管内,再将试管斜放试验台上, 凝固后即成普通琼脂斜面培养基 琼脂系由海藻中提取的一种多糖,俗称洋粉,具有100℃溶化,40℃凝固的特性 细菌不能分解琼脂,故无营养作用,仅是固体培养基的赋形剂。 普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂培养基的各种成分并已 调好pH)制备,用法见产品说明书。 (三)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较髙,在普通琼脂培养基上生长不良,可用血液琼脂培养基 进行培养。 【材料】 ①普通琼脂培养基 200ml ②血液(脱纤维羊血或兔血) 10~20ml 【方法】 1.加热溶化普通琼脂培养基。 2.待冷至50℃左右时,加入无菌的脱纤维血液,混匀(注意勿使产生泡沫)。 3.分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。 质粒DNA的提取 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。作 为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒DNA上 携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA 重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主 细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能
② 蛋白胨 2g ③ 氯化钠 1g ④ 琼脂 5g ⑤ 无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等。 【方法】 1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热溶化。 2．趁热用 pH 试纸测酸碱度，用 10％碳酸氢钠校正 pH 为 7.2 左右。 3．15 磅高压蒸气灭菌 20～30min。 4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约 15ml，凝固后即成普 通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上， 凝固后即成普通琼脂斜面培养基。 琼脂系由海藻中提取的一种多糖，俗称洋粉，具有 100℃溶化，40℃凝固的特性。 细菌不能分解琼脂，故无营养作用，仅是固体培养基的赋形剂。 普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂培养基的各种成分并已 调好 pH)制备，用法见产品说明书。 (三)血液琼脂培养基 有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基 进行培养。 【材料】 ① 普通琼脂培养基 200ml ② 血液(脱纤维羊血或兔血) 10～20ml 【方法】 1．加热溶化普通琼脂培养基。 2．待冷至 50℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫)。 3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。 二、质粒 DNA 的提取 质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA，是进行 DNA 重组的常用载体。作 为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒 DNA 上 携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA 重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主 细胞中提取质粒 DNA，是 DNA 重组技术中最基础的实验技能
在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA 链发生断裂。所以,质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图分为:松弛线性的DNA 松弛开环的OC构型;超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA走在最前沿, OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的,它在凝胶中的位置介于 OC DNA和 SC DNA之间。以提取小量质粒 为例 )煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holme和 Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程 中,DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA序列,在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA的纯度和甲基 化程度等。对DNA进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选 用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性 琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要, 还可以从凝胶中回收DNA条带,用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA,可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液( 般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受 分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1.器材微量移液器(2oμl、200ul、1000ul),台式髙速离心机,恒温振荡 摇床,髙压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置 恒温水浴锅,1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管,离心管架
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒 DNA 链发生断裂。所以，质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图分为：松弛线性的 DNA； 松弛开环的 OC 构型；超螺旋的 SC 构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭，因此，在紫外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA 走在最前沿， OC DNA 则位于凝胶的最后边；道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的，它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间。以提取小量质粒 为例。 一）煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holmex 和 Quigley（1985）的方法改进而成的。在基因工程 中，DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基 化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选 用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要， 还可以从凝胶中回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA。长度 100kb 或更大的 DNA，可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一 般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受 分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1. 器材 微量移液器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，恒温振荡 摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置， 恒温水浴锅，1.5ml 塑料离心管（又称 eppendorf 管），离心管架
2.菌种含卡那酶素的E. coli dh5a 3.试剂LB培养基,氨苄青霉素母液,溶菌酶溶液,3 mol naAc(pH5.2), 溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,RNA酶,A母液,饱和酚,氯仿,70%乙醇,无水 乙醇,异丙醇,T缓冲液,STET,STE,TBE缓冲液(5×),上样缓冲液(6 ),1%琼脂糖凝胶,DNA标准分子量标记物,溴化乙锭。 【方法】 1.细菌的培养和收集:将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50ug/ml Amp)中,37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLB液体培养基 (含50 ug/ml Kan)中,37℃振荡培养约12h至对数生长后期。 2.裂解细菌 (1)无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管( Eppendorf管)中,微量 离心机上10000pm离心lmin,或者以4000pm离心5~10min,弃上清液,倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 (2)将菌体沉淀悬浮于350μSTET缓冲溶液中,涡旋使其混匀。 (3)加入25山新配制的溶菌酶溶液(l0mg/m,用10 mmol/ Tris-CI(pH8.0) 配制),涡旋振荡大概3s。 (4)将 eppendorf管放入沸水浴中,40s后立即取出 (5)微量离心机上以4℃,12000mp离心10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 (6)在上清液中加入40μ5mol乙酸钠(pH5.2)和420山l异丙醇,振荡 混匀,于室温放置5min。 (7)微量离心机上以4℃,12000mp离心5min,回收核酸沉淀。小心吸 去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 (8)加入1m70%乙醇,以4℃,12000rmp离心2min。轻轻地吸去上清 液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇 液滴,室温下放置,直至乙醇挥发完全,管内无可见的液体为止(大概需要 2~5min)。 (9)用50l无DNA酶的胰RNA酶(2oμg/ml)的TE(pH8:0)溶解核酸, 稍加振荡即可,贮存于-20℃ 3.分离和纯化质粒DNA
2. 菌种 含卡那酶素的 E. coli DH5α。 3. 试剂 LB 培养基，氨苄青霉素母液，溶菌酶溶液，3mol/l NaAc (pH5.2)， 溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNA 酶，A 母液，饱和酚，氯仿，70%乙醇，无水 乙醇，异丙醇，TE 缓冲液，STET，STE，TBE 缓冲液 (5×)，上样缓冲液（6 ×），1%琼脂糖凝胶，DNA 标准分子量标记物，溴化乙锭。 【方法】 1. 细菌的培养和收集 ：将含有质粒菌种接种在 LB 固体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37℃培养 12~24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基 （含 50μg/ml Kan）中，37℃振荡培养约 12h 至对数生长后期。 2. 裂解细菌 （1）无菌操作台上取 1.5ml 培养菌体置于离心管（Eppendorf 管）中，微量 离心机上 10 000rpm 离心 1min，或者以 4000rpm 离心 5~10min，弃上清液，倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 （2）将菌体沉淀悬浮于 350μl STET 缓冲溶液中，涡旋使其混匀。 （3）加入 25μl 新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml，用 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0） 配制），涡旋振荡大概 3s。 （4）将 eppendorf 管放入沸水浴中，40s 后立即取出。 （5）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 （6）在上清液中加入 40μl 5mol/L 乙酸钠（pH5.2）和 420μl 异丙醇，振荡 混匀，于室温放置５min。 （7）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 5min，回收核酸沉淀。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 （8）加入 1ml 70％乙醇，以 4℃，12 000rmp 离心 2min。轻轻地吸去上清 液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇 液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止（大概需要 2~5min）。 （9）用 50μl 无 DNA 酶的胰 RNA 酶（20μg/ml）的 TE（pH8.0）溶解核酸， 稍加振荡即可，贮存于-20℃。 3. 分离和纯化质粒 DNA
(1)配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶,加入100 ml tBe缓冲液,称 取lg琼脂糖加入缓冲液中,沸水浴加热至完全溶解,然后在55℃水浴中保温 在灌胶模具中插入梳齿,将稍微冷却的凝胶倒λ灌胶模具。凝胶厚度3~5mm, 避免气泡产生。 (2)室温放置30~45min,待凝胶完全凝固后,按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 (3)在电泳槽中加入电泳缓冲液,电泳缓冲液没过胶面1mm,拔下梳齿形 成样品池。 (4)取样品与6×样品缓冲液按照比例混合后,用微量移液器缓慢加入样 品池中。 (5)盖上电泳槽并且通电,注意电源正负极,确保样品向阳极移动。恒压 l~-sv/cm(按照两极之间距离计算),至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端lcm 时,切断电源 (6)从电泳槽中取出凝胶,将凝胶置于0.5ugml溴化乙啶水溶液中,室温 下振摇染色30~45mn (7)回收染色液,自来水冲洗凝胶后,于紫外灯下观察。 【注意事项】 1.大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 添加溶菌酶一定要有限度,浓度过髙细菌裂解效果反而不好,有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实 验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时,一定要除尽 3.用π0%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎,防止将核酸同洗液 起倒掉。实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4!.当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA株,如HBl01)中小量制 粒DNA时,建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,在 Mg2存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。若要避免这一问题 可以在用70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5.如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1 HI dNA溶液加到另一个含 8μl水的微量离心管内,加lu10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜
（1）配制 1%琼脂糖凝胶。取 250ml 三角瓶，加入 100ml TBE 缓冲液，称 取 1g 琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在 55℃水浴中保温。 在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度 3~5mm， 避免气泡产生。 （2）室温放置 30~45min，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 （3）在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面 1mm，拔下梳齿形 成样品池。 （4）取样品与 6×样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样 品池中。 （5）盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压 1~5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端 1cm 时，切断电源。 （6）从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于 0.5ug/ml 溴化乙啶水溶液中，室温 下振摇染色 30~45min。 （7）回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 【注意事项】 1. 大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 添加溶菌酶一定要有限度，浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒 DNA 中会含有 RNA，但 RNA 并不干扰进一步实 验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时，一定要除尽。 3. 用 70%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液 一起倒掉。 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4. 当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌株（endA+株，如 HB101）中小量制 粒 DNA 时，建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在 Mg2+存在下温育（V 中用限制酶时）质粒 DNA 可被降解。 若要避免这一问题 可以在用 70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5. 如果要通过限酶切割反应来分析 DNA，可取 1μl DNA 溶液加到另一个含 8μl 水的微量离心管内，加 1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜
温度温育1~2h。将剩余的DNA贮存于-20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化 的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开,很有可能在收获细菌的 步骤中未能很好地去除所有上清液体。这种情况下,可用酚:氯仿抽提DNA终 产物,然后用乙醇重新沉淀DNA,通常,用5~10倍过量的酶(特别是并不昂贵 的酶)在100~200山体积中进行消化,可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇 到的困难。消化后,加0.1体积3moL乙酸钠(pH52)和2倍体积乙醇沉淀DNA 6.溴化乙啶是一种强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务 必戴手套。7.紫外线对人体,尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射,必 须确保紫外线光源受到遮蔽 )碱裂解法 【原理】 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高,适于多数的菌株 所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制 备。十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解, 又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后,会导致细菌细胞破裂,释放出质 粒DNA和染色体DNA,两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体 的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,却仍然缠绕在一起不分开;但后 者完全变性分甚至出现断裂,因此,当加入pH48的酸性乙酸钾降低溶液pH值, 使溶液pH值恢复较低的近中性水平时,质粒的两条小分子单链可迅速复性恢 复双链结构,但是主染色体DNA则难以复性。在离心时,大部分主染色体与细 胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异 丙醇沉淀、乙醇洗涤,可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直 接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。 【材料】 1.溶液ⅠpH8.0GET缓冲液(50mmol葡萄糖,10 mmo/EDTA,25 mmol/L Tris-HCI。 2.溶液Ⅱ0.2 molL Naoh(内含1%的SDS),这个用的时候需现配 3.溶液ⅢplH48乙酸钾溶液(60ml5 mol/L Kac,15ml冰醋酸,28.5ml H2O)。 4.pH8.0T缓冲液(10 mmol/L Tris-HCI, ImMoI/L EDTA,其中含RNA酶 20ugm)。5.其余试剂同煮沸法
温度温育 1~2h。将剩余的 DNA 贮存于-20℃。通过凝胶电泳分析经限制酸消化 的 DNA 片段。如果小量制备的 DNA 不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的 步骤中未能很好地去除所有上清液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提 DNA 终 产物，然后用乙醇重新沉淀 DNA，通常，用 5~10 倍过量的酶（特别是并不昂贵 的酶）在 100~200μl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇 到的困难。消化后，加 0.1 体积 3mol/L 乙酸钠（pH5.2)和 2 倍体积乙醇沉淀 DNA。 6. 溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务 必戴手套。 7. 紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必 须确保紫外线光源受到遮蔽。 二）碱裂解法 【原理】 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株， 所得产物经纯化后可满足多数的 DNA 重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制 备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解， 又能使一些蛋白质变性。用 SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质 粒 DNA 和染色体 DNA，两种 DNA 在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体 的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后 者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值， 使溶液 pH 值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢 复双链结构，但是主染色体 DNA 则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细 胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中。再由异 丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA。碱裂解法提取的质粒 DNA 可直 接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析等。 【材料】 1. 溶液Ｉ pH8.0 GET 缓冲液（50mmol 葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-HCl）。 2. 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（内含 1％的 SDS），这个用的时候需现配。 3. 溶液Ⅲ pH4.8 乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml 冰醋酸，28.5ml H2O）。 4. pH8.0 TE 缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA 酶 20ug/ml）。 5. 其余试剂同煮沸法
【方法】 1.细菌的培养和收集(同煮沸法)。 2.裂解细菌 (1)无菌操作台上,取1.5m培养菌体置于离心管( Eppendorf管)中,微 量离心机上以4℃,10000pm离心1min,或者以4000pm离心5-10min,弃上 清液,离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。 (2)沉淀中加100u山用冰预冷的溶液I,加或不加入少量溶菌酶粉末,充分 混合(需要剧烈振荡)。室温下放置10mins (3)加入200u溶液Ⅱ(新鲜配置),加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀 (千万不要振荡),冰浴5min (4)加入150山预冷溶液II,轻轻颠倒数次混匀(10s),置于冰浴15min 微量离心机上以4℃,1200opm离心l5mi,取上清液于另一新 Eppendorf管中 (5)上清液中加入等体积酚氯仿(1:1)混匀,微量离心机上以4℃,12000pm 离心5min。如果选用宿主合适的话(如DH5a、XL1-blue等,HBl01和BL21 则不行),可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇沉淀,沉淀中所含的 盐和RNA就很少了,完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒,后续的限 制性酶切转化完全没有问题。小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下 层的有机相。 (6)小心移出上液于一新 Eppendorf管中,加入2/3倍体积异丙醇,混匀 4℃离心12000g离心5min。 (7)上清液中加入2倍体积的无水乙醇混匀,室温下放置5~10min,以 000pm,离心5~15min。 (8)lonl预冷的π0%乙醇洗涤沉淀1~2次,沉淀在室温下晾干。小心吸 去上清液,将离心管倒置于一张纸上,使所有的液体流出。再将附着在管壁上的 液滴除去。在除去管壁上的液滴时,可以用一次性吸头与真空管相连,用吸头接 触液面。但在液体吸岀时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干 到看不到液滴最好。 (9)加入50uT缓冲液(pH8020μg/ mI rnasea)溶解质粒粗提物,在-20℃ 保存。 3.分离和纯化质粒DNA(同煮沸法) 【注意事项】
【方法】 1. 细菌的培养和收集（同煮沸法）。 2. 裂解细菌 （1）无菌操作台上，取 1.5ml 培养菌体置于离心管（Eppendorf 管）中，微 量离心机上以 4℃，10000rpm 离心 1min，或者以 4000rpm 离心 5~10min，弃上 清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。 （2）沉淀中加 100μl 用冰预冷的溶液 I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分 混合（需要剧烈振荡）。室温下放置 10min。 （3）加入 200μl 溶液 II（新鲜配置），加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀 （千万不要振荡），冰浴 5min 。 （4）加入 150μl 预冷溶液 III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴 15min 。 微量离心机上以 4℃，12 000rpm 离心 15min，取上清液于另一新 Eppendorf 管中。 （5）上清液中加入等体积酚/氯仿（1:1）混匀，微量离心机上以 4℃，12000rpm, 离心 5min。如果选用宿主合适的话（如 DH5a、XL1-blue 等，HB101 和 BL21 则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用 1 倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的 盐和 RNA 就很少了，完全去除上清液后就可以直接加 TE 溶解质粒，后续的限 制性酶切转化完全没有问题。小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下 层的有机相。 （6）小心移出上液于一新 Eppendorf 管中，加入 2/3 倍体积异丙醇，混匀， 4℃离心 12000g 离心 5min。 （7）上清液中加入 2 倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置 5~10min，以 12 000rpm，离心 5~15min。 （8）1.0ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 1~2 次，沉淀在室温下晾干。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的 液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接 触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干 到看不到液滴最好。 （9）加入 50μl TE 缓冲液（pH8.0 20μg/ml RNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃ 保存。 3. 分离和纯化质粒 DNA（同煮沸法）。 【注意事项】
1.提取过程应尽量在低温环境中进行 2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,蛋白质的去除以酚氯仿混合效 果最好,可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净。 3.在沉淀DNA时通常使用冰乙醇,在低温条件下放置可使DNA沉淀完全 4.同时反应中加入的盐浓度一定要控制好,当加入的盐溶液浓度太低时 只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的 钾溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在, 影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最 终浓度达0.1~0.25moL为宜。 【附注】 所用试剂配法 1.LB液体培养基( Luria- Bertani):称取蛋白胨( Tryptone)10g,酵母提取 物( Yeast extract)5g,NaCl10g,溶于800m去离子水中,用NaOH调pH至75, 加去离子水至总体积LL,高压下蒸气灭菌20min 2.LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3.氨苄青霉素( Ampicillin,Amp)母液:配成50mg/m水溶液,-20℃保存 备用。 4.溶菌酶溶液:用10mmo/TiCl(pH80)溶液配制成10mg/ml,并分装 成小份(如1.5m)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5.3 mol/I naAc(pH52):50m水中溶解40.81 g naAc3H2O,用冰醋酸调pH 至52,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱 6.溶液I:50mmoL葡萄糖,25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),10mmol/ LEDTA (pH80)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15min,储存于4℃冰箱 7.溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH(临用前用5~10 mol/l Naoh母液稀释),1% 8溶液Ⅲ:5 MoL/L KAc60ml,冰醋酸115ml,H2O28.5ml,定容至100ml 并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3moL,Ac-5molL。 9RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10 mmol/L Tris-CI(pH75),15mmol/ NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15min,使混有的DNA酶失活。 冷却后用1.5 ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃ 10.饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂
1. 提取过程应尽量在低温环境中进行。 2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效 果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净。 3. 在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。 4. 同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时， 只有部分 DNA 形成 DNA 钾盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的 钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在， 影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最 终浓度达 0.1~0.25mol/L 为宜。 【附注】 所用试剂配法 1. LB 液体培养基（Luria-Bertani）： 称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取 物（Yeast extract）5g，NaCl10g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5， 加去离子水至总体积 1L，高压下蒸气灭菌 20min。 2. LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g 琼脂粉，高压灭菌。 3. 氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成 50mg/ml 水溶液，-20℃保存 备用。 4. 溶菌酶溶液：用 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液配制成 10mg/ml，并分装 成小份（如 1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。 5. 3mol/l NaAc（pH5.2）：50ml 水中溶解 40.81g NaAc·3H2 O，用冰醋酸调 pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分装后高压灭菌，储存于 4℃冰箱。 6. 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA （pH8.0）。 溶液Ⅰ可成批配制，每瓶 100ml，高压灭菌 15min，储存于 4℃冰箱。 7. 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（临用前用 5~10mol/L NaOH 母液稀释），1％ SDS。 8. 溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L，Acˉ5mol/L。 9. RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris-Cl（pH7.5），15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加热 15min，使混有的 DNA 酶失活。 冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。 10. 饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂
及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1% 的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5 mol/L Tris-CI(pH8.0)和0.1molL Tris-Cl(pH80)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到76以上,因为酸性 条件下DNA会分配于有机相。 11.氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积 体积=1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀 性,操作时应戴手套 12.TE缓冲液:10 mmo/L Tris-Cl(pH80),1 mmO/L EDTA(pH80)。高压 灭菌后储存于4℃冰箱中。 13. STET: 0.1 mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0), 10 mmoVL EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100. 14.STE: 0.1mol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0), Immol/L EDTA(pH8.0)o 15.电泳所用试剂:(1)TBE缓冲液(5×):称取Ti54g,硼酸27.5g, 并加入0.5 MEDTA(pH80)20m,定溶至1000m。(2)上样缓冲液(6×) 0.25%溴酚蓝,40%(w/)蔗糖水溶液。 16.溴化乙锭:水中加入溴化乙啶,搅拌数小时至溶解。将配好的10mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中,室温保存,使用时稀释至0.5μg/ml。 7.溶液I:pH8.0GET缓冲液(50mmol葡萄糖,l0 mmol/EDTA,25 mmol/L Tris-HCl):溶液Ⅰ可成批配制,在(6895×104Pa)高压下蒸气灭菌15min,贮 存于4℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部,增 加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDIA是Ca 和Mg2等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌 细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制 DNase;对DNA的降解和抑制 微生物生长的作用。 18.溶液Ⅱ:0.2mol/ L Naoh(内含1%的SDS),这个用的时候需现配。要 新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最 佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会在瞬间溶 解,这是由于细胞膜发生了从 bilayer(双层膜)结构向 micelle(微囊)结构的 相变化。用不新鲜的0.4 N NaoH,即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS 是离子型表面活性剂。它主要作用是:a溶解细胞膜上的脂质与蛋白,从而破坏
及导致 RNA 和 DNA 的交联，应在 160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入 0.1％ 的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/L Tris-Cl（pH8.0）和0.1mol/L Tris-Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上，因为酸性 条件下 DNA 会分配于有机相。 11. 氯仿：按氯仿:异戊醇=24:1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/ 体积=1:1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀 性，操作时应戴手套。 12. TE 缓冲液：10 mmo/L Tris-Cl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。高压 灭菌后储存于 4℃冰箱中。 13. STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA （pH8.0），5% Triton X-100。 14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。 15. 电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g， 并加入 0.5M EDTA （pH8.0）20ml，定溶至 1000ml。（2）上样缓冲液（6×）： 0.25% 溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。 16. 溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的 10mg/ml 溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至 0.5μg/ml。 17. 溶液Ｉ：pH8.0 GET 缓冲液（50mmol 葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌 15min，贮 存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增 加溶液的粘度，维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA 是 Ca2 ＋ 和 Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I 中加入 EDTA，是要把大肠杆菌 细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制 DNase; 对 DNA 的降解和抑制 微生物生长的作用。 18. 溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（内含 1%的 SDS），这个用的时候需现配。要 新配置溶液Ⅱ是为了避免 NaOH 接触空气中的 CO2 而减弱了碱性。NaOH 是最 佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶 解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的 相变化。用不新鲜的 0.4N NaOH，即便有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌。SDS 是离子型表面活性剂。它主要作用是：a.溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏
细胞膜。b.解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为ROSO3-R蛋白质的 复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在接下 来的提取过程必须把它去除干净,以便下一步试验的更好进行 19.溶液Ⅲ:pH48乙酸钾溶液(60ml5 MOIL KAc,11.5m冰醋酸,28.5ml HO);该溶液钾离子浓度为3mo,醋酸根离子浓度为5 moIL pH4.8的乙酸钾 溶液是为了把抽提液的pH调至中性,从而使变性的质粒DNA复性,且稳定存 在。溶液I加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS, 而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝 聚,使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合, 后者是因为盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的盐形式复合物。 20.采用PEG(6000沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓 度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓 度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20% 21.无水乙醇:乙醇可以以任意比和水相混溶,而DNA溶液是DNA以水 合状态稳定存在,同时乙醇与核酸不起化学反应,因此是理想的沉淀剂。加入的 乙醇后,乙醇会夺去DNA周围的水分子,DNA失水聚合。一般实验中,是加2 倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。也可改用95% 乙醇来替代无水乙醇。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有 定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得 率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步 骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室 温下放置15~30min即可。但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来,所以较多的还 是使用乙醇。 22.pH80T缓冲液:10 mmolL Tris-HC,lmmo/ L EDTA,其中含RNA 酶2oug/ml。在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性 及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9,24) 等虽然也都符合细胞内环境的生理范 围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将 与Ca2产生Ca3(PO4沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数 量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用 Tris-HCI (pKa=80)的缓冲系统,由于缓冲液是 TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作
细胞膜。b.解聚细胞中的核蛋白。c.能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R ＋ -蛋白质的 复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下 来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。 19. 溶液Ⅲ：pH4.8 乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml 冰醋酸，28.5ml H2O）；该溶液钾离子浓度为 3mol/L，醋酸根离子浓度为 5mol/L pH4.8 的乙酸钾 溶液是为了把抽提液的 pH 调至中性，从而使变性的质粒 DNA 复性，且稳定存 在。溶液 III 加入后的沉淀实际上是 K+置换了SDS 中的Na+形成了不溶性的 PDS， 而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝 聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合， 后者是因为盐与 SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。 20. 采用 PEG（6000）沉淀 DNA，大小不同的 DNA 分子所用的 PEG 的浓 度也不同，PEG 的浓度低，选择性沉淀 DNA 分子量大，大分子所需 PEG 的浓 度只需 1%左右，小分子所需 PEG 浓度高达 20%。 21. 无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而 DNA 溶液是 DNA 以水 合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入的 乙醇后，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，DNA 失水聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67%左右。也可改用 95% 乙醇来替代无水乙醇。但是加 95%的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一 定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得 率。折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步 骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室 温下放置 15~30min 即可。但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还 是使用乙醇。 22. pH8.0 TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA 酶 20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性 及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统（pKa=9.24） 等虽然也都符合细胞内环境的生理范 围（pH），可作 DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将 与 Ca2+产生 Ca3(PO4)2 沉淀；在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数 量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl （pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+ /Tris，不存在金属离子的干扰作