医学微生物 学与免疫学 实验讲义
医学微生物 学与免疫学 实验讲义
前言 《医学微生物学与免疫学实验指导》为适应我国高等医学教育改革和发展的需要,培养 新世纪的实用型医学人才,提高学生的动手、合作能力,在院校有关部门的组织支持下,经 过教研室全体教师的共同努力,编写了这本实用性医学微生物学和免疫学实验指导,为了使 学生在有限的时间内熟练掌握基础理论知识和基本技能。希望能借此提高学生的实验课质 量,为今后的临床工作打下扎实的基础 本实验课程为专业必修课,在选择实验内容和编写过程时,我们努力做到与教材配套。 为满足教学需要,培养学生理论联系实际,独立思考、操作的能力,在借鉴其它医学院校相 关实验教材的同时,结合我校的实际情况,注意素质教育同时,注重培养创新性与实践性人 才。本实验教材实验总共44学时,其中微生物学28学时,免疫学16学时,微生物学内容 包括:基础验证性实验和综合设计性实验两部分。为满足医学专业需求,内容从简单到复杂 从基本到综合,在顺序上打破了传统的实验编排,在内容上尝试让学生设计综合鉴定性实验。 本书注重实验方法的说明,并提供必要的图表,便于学生对实验的理解和操作。书后附录了 常用染液和培养基的配置用途、医学微生物英汉基本词汇,便于学生学习和查阅。 本书供临床、护理、影像、麻醉等医学专业使用,由于各专业能力要求的重点不同,因 此,编排实验内容时考虑了教材的兼容性和实用性 衷心感谢参编单位领导和同事对本教材编写的支持和帮助。由于编者水平有限,以及编 写时间紧迫,书中难免存在缺点和不足,恳请前辈和广大师生给予指正,我们将在今后的教 学工作中不断加以补充和完善
前 言 《医学微生物学与免疫学实验指导》为适应我国高等医学教育改革和发展的需要，培养 新世纪的实用型医学人才，提高学生的动手、合作能力，在院校有关部门的组织支持下，经 过教研室全体教师的共同努力，编写了这本实用性医学微生物学和免疫学实验指导，为了使 学生在有限的时间内熟练掌握基础理论知识和基本技能。希望能借此提高学生的实验课质 量，为今后的临床工作打下扎实的基础。 本实验课程为专业必修课，在选择实验内容和编写过程时，我们努力做到与教材配套。 为满足教学需要，培养学生理论联系实际，独立思考、操作的能力，在借鉴其它医学院校相 关实验教材的同时，结合我校的实际情况，注意素质教育同时，注重培养创新性与实践性人 才。本实验教材实验总共 44 学时，其中微生物学 28 学时，免疫学 16 学时，微生物学内容 包括：基础验证性实验和综合设计性实验两部分。为满足医学专业需求，内容从简单到复杂， 从基本到综合，在顺序上打破了传统的实验编排，在内容上尝试让学生设计综合鉴定性实验。 本书注重实验方法的说明，并提供必要的图表，便于学生对实验的理解和操作。书后附录了 常用染液和培养基的配置用途、医学微生物英汉基本词汇，便于学生学习和查阅。 本书供临床、护理、影像、麻醉等医学专业使用，由于各专业能力要求的重点不同，因 此，编排实验内容时考虑了教材的兼容性和实用性。 衷心感谢参编单位领导和同事对本教材编写的支持和帮助。由于编者水平有限，以及编 写时间紧迫，书中难免存在缺点和不足，恳请前辈和广大师生给予指正，我们将在今后的教 学工作中不断加以补充和完善
目录 微生物部分 实验目的与要求 错误!未定义书签 实验室规则 基础验证性实验 实验一细菌基本形态的观察 实验二细菌特殊结构的染色和观察 实验三细菌培养 实验四细菌的分布与无菌操作技术 实验五消毒灭菌 实验六抗链球菌溶血素“0”试验 实验七厌氧性细菌 实验八分枝杆菌属 实验九螺旋体 实验十其他细菌 实验十一病原性真菌的检测 实验十二病毒的分离培养 实验十三病毒血凝试验 综合设计性实验 实验十四细菌的生化反应 实验十五病原性球菌感染检查与鉴定 实验十六肠道杆菌的检测 免疫学部分 实验室规则 实验一凝集反应 实验二沉淀反应 实验三细胞分离技术及E花环形成试验 实验四变态反应试验 实验五免疫标记技术 实验六吞噬功能的检测 实验七白细胞介素-2(L-2)生物学活性测定
目 录 微生物部分 实验目的与要求 ............................................. 错误!未定义书签。 实验室规则 基础验证性实验 实验一 细菌基本形态的观察 实验二 细菌特殊结构的染色和观察 实验三 细菌培养 实验四 细菌的分布与无菌操作技术 实验五 消毒灭菌 实验六 抗链球菌溶血素“O”试验 实验七 厌氧性细菌 实验八 分枝杆菌属 实验九 螺旋体 实验十 其他细菌 实验十一 病原性真菌的检测 实验十二 病毒的分离培养 实验十三 病毒血凝试验 综合设计性实验 实验十四 细菌的生化反应 实验十五 病原性球菌感染检查与鉴定 实验十六 肠道杆菌的检测 免疫学部分 实验室规则 实验一 凝集反应 实验二 沉淀反应 实验三 细胞分离技术及 E 花环形成试验 实验四 变态反应试验 实验五 免疫标记技术 实验六 吞噬功能的检测 实验七 白细胞介素-2（IL-2）生物学活性测定
微生物学部分 实验目的与要求 医学微生物学实验课是医学微生物学课程的重要组成部分,是医学生重要的基础课和技 能训练课,也是学生今后临床学习和工作的基础。学习实验课的主要目的是: 1.使学生巩固和加强课堂所学医学微生物学的基础理论知识和基本知识,掌握有关的实 验操作技术,为以后的医学专业课学习打下坚实的基础。 2.培养学生观察、思考、分析和解决问题的能力,培养学生参与实验的主动性、动手能 力及独立工作的能力。熏陶学生严谨的科学态度及严密的工作方法。 3.通过实验,使学生对理论内容加以验证,提高学生学习兴趣的同时也使学生系统地了 解微生物学实验的原理、方法、结果及用途, 4.培养学生的团结协作、互帮互让、和平相处,共同完成实验的美德。 为了达到以上目的,提出下列要求 1.实验课前做好预习,明确本次实验课的目的、内容、原理、方法及注意事项 2.实验中要仔细认真,注意分工与协作,操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手 法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察,并记录好相关内容 3.详细讨论实验结果,提倡同学之间互帮互学,并紧密联系理论课内容。要注意不论实 验结果与理论符合与否,都有讨论的价值,并分析其原因,有可能的话还应重复实验 4.严格遵守实验室规则,在微生物学实验课上,要树立“无菌观点”,严格掌握和不断 完善无菌操作技术
1 微生物学部分 实验目的与要求 医学微生物学实验课是医学微生物学课程的重要组成部分，是医学生重要的基础课和技 能训练课，也是学生今后临床学习和工作的基础。学习实验课的主要目的是： 1. 使学生巩固和加强课堂所学医学微生物学的基础理论知识和基本知识，掌握有关的实 验操作技术，为以后的医学专业课学习打下坚实的基础。 2. 培养学生观察、思考、分析和解决问题的能力，培养学生参与实验的主动性、动手能 力及独立工作的能力。熏陶学生严谨的科学态度及严密的工作方法。 3. 通过实验，使学生对理论内容加以验证，提高学生学习兴趣的同时也使学生系统地了 解微生物学实验的原理、方法、结果及用途。 4. 培养学生的团结协作、互帮互让、和平相处，共同完成实验的美德。 为了达到以上目的，提出下列要求： 1. 实验课前做好预习，明确本次实验课的目的、内容、原理、方法及注意事项； 2. 实验中要仔细认真，注意分工与协作，操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手 法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察，并记录好相关内容； 3. 详细讨论实验结果，提倡同学之间互帮互学，并紧密联系理论课内容。要注意不论实 验结果与理论符合与否，都有讨论的价值，并分析其原因，有可能的话还应重复实验； 4. 严格遵守实验室规则，在微生物学实验课上，要树立“无菌观点”，严格掌握和不断 完善无菌操作技术
实验室规则 医学微生物学实验研究对象大都是有传染性的病原微生物,为防止感染必须严格遵守实 验室规则: 课前要预习,进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书、文具外,其它个人 物品一律不得带入实验室。 、实验室禁止饮食、吸烟及与学习无关的活动,室内应保持清洁、安静,实验时要认 真严肃,不得大声喧哗或嬉戏 三、未经老师允许,实验室内任何物品不得擅自搬动和带出室外。 四、实验必须按计划进行,严格遵守操作规程认真操作。爱护实验室内的仪器,使用 显微镜及其它贵重仪器时要严格按要求操作 五、爱护室内一切设施,注意节约实验消耗材料及药品,节约用水及安全用电。 六、实验中若打翻菌液、带菌材料污染桌面、地板、书籍、衣物或割破手指,应及时报 告老师进行处理,切勿自作主张不按规定处理。 七、实验结束,用过的带菌材料如玻片、试管等应放在消毒缸、消毒箱等消毒,污染物 放到指定的地方统一处理,不得放在桌上或冲洗于水槽内。要清理桌面,将实验材料整理好 放回原处 八、值日生应彻底打扫卫生,保持室内整齐,洗手后方可离开实验室,离开前要关好水、 电、门窗。 2
2 实验室规则 医学微生物学实验研究对象大都是有传染性的病原微生物，为防止感染必须严格遵守实 验室规则： 一、课前要预习，进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书、文具外，其它个人 物品一律不得带入实验室。 二、实验室禁止饮食、吸烟及与学习无关的活动，室内应保持清洁、安静，实验时要认 真严肃，不得大声喧哗或嬉戏。 三、未经老师允许，实验室内任何物品不得擅自搬动和带出室外。 四、实验必须按计划进行，严格遵守操作规程认真操作。爱护实验室内的仪器，使用 显微镜及其它贵重仪器时要严格按要求操作。 五、爱护室内一切设施，注意节约实验消耗材料及药品，节约用水及安全用电。 六、实验中若打翻菌液、带菌材料污染桌面、地板、书籍、衣物或割破手指，应及时报 告老师进行处理，切勿自作主张不按规定处理。 七、实验结束，用过的带菌材料如玻片、试管等应放在消毒缸、消毒箱等消毒，污染物 放到指定的地方统一处理，不得放在桌上或冲洗于水槽内。要清理桌面，将实验材料整理好 放回原处。 八、值日生应彻底打扫卫生，保持室内整齐，洗手后方可离开实验室，离开前要关好水、 电、门窗
基础验证性实验 实验一细菌基本形态的观察 由于细菌个体微小,需借助显微镜,才能够看清细菌的形状、大小、结构、排列及染色 特性等。因此,同学们首先要熟练掌握油镜的使用及保护。 、显微镜油镜头的使用及保护 【使用原理】 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。油镜的透镜很小,光线通过玻片与油 镜头之间的空气时,因介质密度不同,发生折射或全反射,使射入透镜的光线减少,物象显 现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率相近的香柏油和液体石蜡,避免光线散射, 使进入透镜的光线增多,视野亮度增强,观察物象更加清楚 3 1、光线C、D、C’、D’通过载玻片经香柏油 折射,使进入物镜中的光线量较多。 2、光线A、B、A'、B’通过载玻片经空气折 射,使进入物镜中的光线量减少 图1-1油镜的使用原理 【操作方法】 1.物镜的放大率可由其外形辨认,镜头长度越大,镜片直径越小,放大倍数越大;反之, 放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜,镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线,并 刻有100×或oil等字样。 2.使用显微镜油镜时,必须将显微镜端正直立桌上,不得将镜臂弯曲,以免使载物台倾 斜,松柏油流溢,影响观察,污染台面。 3.调试:打开电源,先采用低倍镜,上下移动集光器和光圈,使视野达到清晰光亮。将 标本片固定于载物台上,镜头对准标本面,先用低倍镜找出标本的位置,转动粗螺旋使镜筒 上升,在标本的待检部位滴加一滴香柏油,改换油镜头观察。 4.调焦距 (Ⅰ)转动粗螺旋使载物台徐徐上升,同时眼睛从右侧观察镜筒下降程度,至油镜头浸入 油中。小心操作,以免压碎标本片或损坏镜头。 (2)用双眼观察目镜,反方冋缓慢地转动粗螺旋,下降载物台,待看到模糊物象时,换 用细螺旋,转动至物象完全清晰为止
3 基础验证性实验 实验一 细菌基本形态的观察 由于细菌个体微小，需借助显微镜，才能够看清细菌的形状、大小、结构、排列及染色 特性等。因此，同学们首先要熟练掌握油镜的使用及保护。 一、显微镜油镜头的使用及保护 【使用原理】 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。油镜的透镜很小，光线通过玻片与油 镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显 现不清。若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率相近的香柏油和液体石蜡，避免光线散射， 使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，观察物象更加清楚。 图 1-1 油镜的使用原理 【操作方法】 1.物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数越大；反之， 放大倍数越小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线、白线或蓝线，并 刻有 100×或 oil 等字样。 2.使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，以免使载物台倾 斜，松柏油流溢，影响观察，污染台面。 3.调试：打开电源，先采用低倍镜，上下移动集光器和光圈，使视野达到清晰光亮。将 标本片固定于载物台上，镜头对准标本面，先用低倍镜找出标本的位置，转动粗螺旋使镜筒 上升，在标本的待检部位滴加一滴香柏油，改换油镜头观察。 4.调焦距： ⑴ 转动粗螺旋使载物台徐徐上升，同时眼睛从右侧观察镜筒下降程度，至油镜头浸入 油中。小心操作，以免压碎标本片或损坏镜头。 ⑵ 用双眼观察目镜，反方向缓慢地转动粗螺旋，下降载物台，待看到模糊物象时，换 用细螺旋，转动至物象完全清晰为止。 1、光线 C、D、C’、D’通过载玻片经香柏油 折射，使进入物镜中的光线量较多。 2、光线 A、B、A’、B’通过载玻片经空气折 射，使进入物镜中的光线量减少
(3)观察时只用细螺旋调节,需改换视野时,右手操纵推进器,左手转动细螺旋,做到 配合自如。并养成左眼观察,右眼绘图的习惯 (4)实验完毕,先提髙镜筒,并将油镜头扭向一侧,再取下标本片。油镜头使用后须用 擦镜纸滴加适量酒精和乙醚混合液(η:3)将镜头上的油擦洗干浄。不用时将物镜转成“八” 字形,载物台降至低点,下降集光器,关上光圈,套上保护罩,双手平托放回原处 镜 镜臂 镜台 光源 聚光镜 图1-2普通光学显微镜结构图 【油镜头的保护】 1显微镜是精密仪器,使用时要注意爱护,切勿随意拆卸和碰撞。 2.强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件,均需注意不使其接触显微镜。 3细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分,每旋转一周使镜筒上升或下降0.1毫 米,只能往返回转,即向一个方向转动数周,遇阻力时,应反方向转动 4显微镜不用时放入镜柜,避免直射日光,置于干燥处,以防受潮。 【注意事项】 1.显微镜使用时,如发现问题或配件短缺应及时向老师报告并进行登记,以便检修 2观察不染色标本时,需下降集光器并适当地缩小光圈,使光度减弱:观察染色标本时 光度宜强,应将显微镜亮度开关调至最亮,光圈完全打开,并上升集光器至与载物台相平 3.使用直筒显微镜观察标本时,必须两眼同时睁开,训练使用左眼观察,右眼绘图 如用油镜头观察,勿将镜身歪斜,避免镜油流出片面。 4.使用完毕,勿必擦去镜头油, 二、细菌基本形态观察(示教) 1.球形:葡萄球菌G—一菌体正圆形,染成蓝紫色,呈现葡萄串状排列。Gˉ球菌
4 ⑶ 观察时只用细螺旋调节，需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到 配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。 ⑷ 实验完毕，先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后须用 擦镜纸滴加适量酒精和乙醚混合液（7：3）将镜头上的油擦洗干净。不用时将物镜转成“八” 字形，载物台降至低点，下降集光器，关上光圈，套上保护罩，双手平托放回原处。 图 1-2 普通光学显微镜结构图 【油镜头的保护】 1.显微镜是精密仪器，使用时要注意爱护，切勿随意拆卸和碰撞。 2.强酸、强碱、氯仿、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件，均需注意不使其接触显微镜。 3.细调节器是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降 0.1 毫 米，只能往返回转，即向一个方向转动数周，遇阻力时，应反方向转动。 4.显微镜不用时放入镜柜，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。 【注意事项】 1.显微镜使用时，如发现问题或配件短缺应及时向老师报告并进行登记，以便检修。 2.观察不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；观察染色标本时， 光度宜强，应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，并上升集光器至与载物台相平。 3. 使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。 如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。 4. 使用完毕，勿必擦去镜头油。 二、细菌基本形态观察（示教） 1. 球形：葡萄球菌G ＋——菌体正圆形，染成蓝紫色，呈现葡萄串状排列。G+球菌
2.杆形:大肠杆菌Gˉ——菌体短杆状,染成红色,呈不规则分散排列。G杆菌 3.螺形:霍乱弧菌Gˉ—一菌体弧形,染成红色,呈不规则分散排列。G弧菌。 革兰染色法(操作) 细菌革兰染色有助于鉴别细菌 【原理】 细菌的等电点较低,约在pH2~5之间,故在中性、碱性或弱碱性溶液中,菌体蛋白质电 离后带负电荷,易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合,使细菌被染成紫色或 红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法,籍此染色法,可将所有细菌区分为 两大类。 【材料】 1.葡萄球菌、大肠杄菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2.革兰染色液。 3.生理盐水,载物玻片,接种环等。 【方法】 1.制片: )灭菌:接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌(图1-3),直至金属丝烧红,然 后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌,重复三次 2)涂片 ①取清洁无油污载物玻片一张,已灭菌接种环沾取生理盐水1-2环置于玻片中央。 ②用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持菌种的试管盖,并立即火焰烧灼试管口灭 ③再用已灭菌冷却接种环伸入试管中,沾取少许葡萄球菌或大肠杄菌菌苔,混于生理盐 水中,轻轻涂成均匀薄膜。 ④再次灭菌试管口,盖好试管,放回原处。 ⑤然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境,接种环灭菌前,须先将接 种环靠近火焰或放内焰中烤干,然后再在外焰中娆红灭菌,杀死残留的细菌。(若菌种为脓 液、痰液等液体标本,注意取菌液时(图1-4)勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口 3)干燥:最好在室温自然干燥,如需加速干燥,也可将涂面向上,远离火焰上方微加温 干燥(离火焰20cm处,切勿加热过度,以防将标本烧枯) 4)固定:标本干燥后,用加热固定法固定。常玻片有菌膜的面向上,在火焰的最热部 分通过酒精灯火焰三次(约2~3秒钟),固定的目的是杀死细菌使之固定于玻片上,并使细 菌蛋白变性,以改变菌体对染料的通透性 2.染色:根据不同的染色要求使用相应染色液进行染色。 ①初染:于涂抹面上滴加结晶紫染液1~2滴,覆盖涂面,室温染色一分钟。用细流水冲 洗剩留染液,甩去片上积水 ②媒染:滴加卢戈碘液,室温作用一分钟,细流水冲洗,甩去积水 ③脱色:将载玻片浸于95%酒精缸中,上下提取,边提边看,直至涂面流下的液体无 色为止(约30秒钟)。细流水冲洗,甩去积水
5 2. 杆形：大肠杆菌G －——菌体短杆状，染成红色，呈不规则分散排列。G-杆菌。 3. 螺形：霍乱弧菌G －——菌体弧形，染成红色，呈不规则分散排列。G-弧菌。 三、革兰染色法（操作） 细菌革兰染色有助于鉴别细菌。 【原理】 细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电 离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或 红色。革兰染色是细菌学中使用最广泛的一种染色方法，籍此染色法，可将所有细菌区分为 两大类。 【材料】 1. 葡萄球菌、大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。 2. 革兰染色液。 3. 生理盐水，载物玻片，接种环等。 【方法】 1．制片： 1）灭菌：接种环以 15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌(图 1-3)，直至金属丝烧红，然 后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌，重复三次。 2） 涂片： ①取清洁无油污载物玻片一张，已灭菌接种环沾取生理盐水 1~2 环置于玻片中央。 ②用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持菌种的试管盖，并立即火焰烧灼试管口灭 菌。 ③再用已灭菌冷却接种环伸入试管中，沾取少许葡萄球菌或大肠杆菌菌苔，混于生理盐 水中，轻轻涂成均匀薄膜。 ④再次灭菌试管口，盖好试管，放回原处。 ⑤然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接 种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。（若菌种为脓 液、痰液等液体标本，注意取菌液时(图 1-4)勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。 3）干燥：最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温 干燥（离火焰20㎝处，切勿加热过度，以防将标本烧枯）。 4）固定：标本干燥后，用加热固定法固定。常玻片有菌膜的面向上，在火焰的最热部 分通过酒精灯火焰三次（约 2~3 秒钟），固定的目的是杀死细菌使之固定于玻片上，并使细 菌蛋白变性，以改变菌体对染料的通透性。 2. 染色：根据不同的染色要求使用相应染色液进行染色。 ①初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液1～2滴，覆盖涂面，室温染色一分钟。用细流水冲 洗剩留染液，甩去片上积水。 ②媒染：滴加卢戈碘液，室温作用一分钟，细流水冲洗，甩去积水。 ③脱色：将载玻片浸于 95%酒精缸中，上下提取，边提边看，直至涂面流下的液体无 色为止（约 30 秒钟）。细流水冲洗，甩去积水
外焰 内焰 图1-3接种环灭菌 图1-4试管中取菌 ④复染:加稀释石炭酸复红染液1~2滴,染色30秒钟,细流水冲洗,吸水纸吸干玻片水 3.油镜检查 【结果】染色片待干后,于油镜下,调强光视野观察,呈紫色的为革兰阳性菌,呈红色 的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色,为革兰阳性,以G表示:大肠杆菌染成红色,为革 阴性,以G表示 【注意事项】 1.脱色是革兰染色中的关键步骤,脱色过度,可使Gˉ菌被误染为G菌;脱色不够 则G菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关,一般以涂片薄而均匀为好。 2.G菌与G菌的染色反应,还受多种因素如菌龄、染色时间、pH等的影响,只有严 格正规操作,才能得到正确结果。 【附注】 与医学有关的常见细菌的革兰染色性:见下页。 2.革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 ①结晶紫酒精饱和液:取14g结晶紫溶于100m195%的酒精内 ②1%草酸铵水溶液:草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水中。 ③将已配好之①液20m和②液80ml混合即成,置瓶中备用。 (2)芦戈( Lugol)氏碘液 ①碘lg:碘化钾2g:蒸馏水300ml ②先将碘化钾2g溶于10om蒸馏水中,再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 30oml即成。供革兰染色媒染用 (3)95%酒精 (4)石炭酸复红稀释液 1份碱性复红饱和液(碱性复红32克溶于95%酒精100m中。即为碱性复红饱和溶液) 加9份5%石炭酸水溶液,先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用),取1份石炭酸复红染液 加9份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮
6 ④复染：加稀释石炭酸复红染液1～2滴，染色30秒钟，细流水冲洗，吸水纸吸干玻片水 分。 3. 油镜检查 【结果】染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色 的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大肠杆菌染成红色，为革 兰阴性，以 G-表示。 【注意事项】 1. 脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度，可使 G+菌被误染为 G- 菌；脱色不够， 则 G- 菌可被误染为 G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。 2. G+菌与 G- 菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH 等的影响，只有严 格正规操作，才能得到正确结果。 【附注】 1. 与医学有关的常见细菌的革兰染色性：见下页。 2. 革兰（Gram）染色液的配制 （1）结晶紫染液 ① 结晶紫酒精饱和液：取 14g 结晶紫溶于 100ml 95％的酒精内。 ② １%草酸铵水溶液：草酸铵 0.8g 溶于 80ml 蒸馏水中。 ③ 将已配好之①液 20ml 和②液 80ml 混合即成，置瓶中备用。 （2）芦戈（Lugol）氏碘液 ① 碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml ② 先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。 （3）95％酒精 （4）石炭酸复红稀释液 1 份碱性复红饱和液（碱性复红 3.2 克溶于 95%酒精 100ml 中。即为碱性复红饱和溶液） 加 9 份 5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取 1 份石炭酸复红染液 加 9 份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮 图 1-3 接种环灭菌 图 1-4 试管中取菌
存于棕色瓶内。 葡萄球菌、链球菌、四联球菌 八叠球菌、肺炎链球菌等 枯草杆菌 需氢芽胆杆菌 革兰氏阳性菌 炭疽杆菌 有芽胞菌 破伤风授菌 厌氧芽胞梭菌{气英棱菌 杆菌 肉毒校菌 白 喉杆菌 芽胞菌 结核杆菌 脑膜炎球菌 淋球菌 大肠杆菌、痢疾杄菌、变形杆菌 革兰氏阴性菌 肠道杆菌{沙门氏菌属:食物中毒沙门氏菌 杆菌 伤寒杆菌、副伤寒杆菌 非肠道杆菌:百日咳杆菌、鼠疫杆菌 霾乱及副霍乱弧菌 实验二细菌特殊结构的染色和观察 特殊结构 1.鞭毛:伤寒杆菌一一菌体较粗大杆状,染成蓝灰色,单个或成堆存在,周围可见到 波浪状弯曲、较长、呈蓝灰色的鞭毛。 2.荚膜:肺炎双球菌一一视野背景为红色,其中可见到染色呈深红色,矛头状菌体 纵向成双排列,菌体周围有未染上颜色的空白区,即荚膜 3.芽胞:破伤风梭菌一一菌体为细长杆状,顶端有染成蓝色、并大于菌体的球状物即 芽胞,呈“鼓槌状”,其它散乱分布的菌体,为菌体脱落的成熟芽胞 、细菌的芽胞染色 【目的】掌握细菌的芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能 使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而 旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着 色力强的染料外,还需要加热,以促进芽胞着色。当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗, 芽胞染上的颜色难以渗出,而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽 胞呈现出不同的颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察
7 存于棕色瓶内。 实验二 细菌特殊结构的染色和观察 一、特殊结构 1. 鞭毛：伤寒杆菌——菌体较粗大杆状，染成蓝灰色，单个或成堆存在，周围可见到 波浪状弯曲、较长、呈蓝灰色的鞭毛。 2．荚膜：肺炎双球菌——视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，矛头状菌体， 纵向成双排列，菌体周围有未染上颜色的空白区，即荚膜。 3. 芽胞：破伤风梭菌——菌体为细长杆状，顶端有染成蓝色、并大于菌体的球状物即 芽胞，呈“鼓槌状”，其它散乱分布的菌体，为菌体脱落的成熟芽胞。 二、细菌的芽胞染色 【目的】 掌握细菌的芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能 使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一 旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着 色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗， 芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽 胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察