交,杂交后,洗去未被杂交上的探针和游离的同位素,放射自显影,使胶片上出现对应于相 应分子量的数量不等的DNA的条带。 Southern blot主要用于基因组DNA特定序列定位。 6.8.1.12DNA的测序 目的:了解目的基因的序列。 DNA的测序有多种方法,近几年开发出了不同的自动测序仪,测序速度快和准确,但 试剂,尤其是设备十分昂贵,如果不是有大量的测序工作,可以采用双脱氧链终止法测序 该方法是应用较多的测序方法,有现成的试剂盒供应。其原理是采用了2,3 ddNTP,在3位 置上缺少一个羟基,当这些 ddNTP掺入到正在延长的DNA链上,由于缺乏3羟基,后继的 dNIP不能与之形成磷酸二酯键,从而使DNA链终止延伸。于是,在DNA合成反应混合物 的4种dNTP中加入少量的一种dNTP,将得到一系列不同长度的核苷酸链,其长度取决于 引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中,加入4种不同的 ddNTP(和一种经标记的dNTP),结果将产生4组长度不均的寡核苷酸,分别终止于模板链 的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳,把四组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上,电泳分离之后,从凝胶的放射 自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列 6.8.1.13PCR、 DDPCR和 RT-PCR PCR是 Polymerase chain reaction的缩写,译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小 时内方便、快捷地将微量DNA(含由RNA反转录成的微量DNA)扩增达10°倍,得到ug 级的DNA!该技术发明于八十年代中期,到了八十年代末,由于引用了耐热DNA聚合酶 使这一技术得以蓬勃发展,成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一,发挥着日益重要的 作用 DDPCR技术是九十年代以来,建立在PCR技术之上发展起来的新技术。 DDPCR是 Differential display PCr的缩写,有人译作“差异展示PCR”或作“异呈PCR”。这一技术主要 用于快速呈现两个或两个以上细胞系或组织基因转录的差异,并快速扩增那些不同转录的基 因片段。 PCR的原理是选用两段引物,分别与拟扩增的模板DNA两条链上各一段序列互补,且 分别位于模板DNA中拟扩增DNA片段两条链的3端。加热使模板DNA变性,降温时,两 段引物分别与靶序列发生退火,然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过 量的两段引物和4种dNTP的反应体中,位于两段引物间的DNA在反复变性、退火、延伸 的循环里,每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板,使其产物增加一倍。经过30-40个 循环,目的DNA可由原来的lpg扩增到lug。 DDPCR的原理是取无DNA污染的总RNA,分别加入三个锚引物,H-T1-C、H-T1-G 和H-T11-A,三个引物的11个T(胸苷)选择性地结合到mRNA的A(腺苷)尾上,在反 转录酶的作用下,将所有的mRNA反转录成cDNA。再以这一含cDNA的反应液为模板,分 别加入以上三个锚引物,和若干随机引物,如 AAGCTTGATTGCC, AAGCTTCGACTGT等 PCR放大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有cDNA,反应体中加入a[3 P]dATP !3SATP。把两个或两个以上细胞系或组织错引物与随机引物相一致的PCR产物相邻 上样于变性测序凝胶上,电泳,放射自显影,曝光。两个或两个以上细胞系或组织相同mRNA 所反转录的cDNA在X片上会出现并列的显影条带,而不同mRNA所反转录的cDNA会出 现独特的显影条带 目前 RT-PCR(反转录PCR)技术使用得十分频繁,在判断、比较不同组别某一mRNA 转录与否或转录多少等方面十分便捷,与 Northern blot相比,程序简单、快,但灵敏度差些, 重复性亦差些,对mRNA提取质量要求高。其原理是先用寡聚胸苷作为引物,反转录所有 mRNA成cDNA,再用拟扩增片段两端的两段引物,PCR扩增该段cDNA。为校正样本RNA 含量组间可能存在的误差,通常在同一试管内一并扩增β肌动蛋白的cDNA。上样电泳,并 染色后,拍照,激光光密度计扫描定量,用β肌动蛋白校正拟扩增的基因片段灰度值,统计 分析。此外,还有原位PCR等等由PCR演变而来的技术。交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，放射自显影，使胶片上出现对应于相 应分子量的数量不等的 DNA 的条带。 Southern blot 主要用于基因组 DNA 特定序列定位。 6．8．1．12 DNA 的测序 目的：了解目的基因的序列。 DNA 的测序有多种方法，近几年开发出了不同的自动测序仪，测序速度快和准确，但 试剂，尤其是设备十分昂贵，如果不是有大量的测序工作，可以采用双脱氧链终止法测序。 该方法是应用较多的测序方法，有现成的试剂盒供应。其原理是采用了 2’,3’ddNTP，在 3’位 置上缺少一个羟基，当这些 ddNTP 掺入到正在延长的 DNA 链上，由于缺乏 3'羟基，后继的 dNTP 不能与之形成磷酸二酯键，从而使 DNA 链终止延伸。于是，在 DNA 合成反应混合物 的 4 种 dNTP 中加入少量的一种 ddNTP，将得到一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于 引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中，加入 4 种不同的 ddNTP（和一种经标记的 dNTP），结果将产生 4 组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链 的每一个 A、C、G 或 T 的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳，把四组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上，电泳分离之后，从凝胶的放射 自显影片上可直接读出 DNA 上的核苷酸序列。 6．8．1．13 PCR、DDPCR 和 RT-PCR PCR 是 Polymerase chain reaction 的缩写，译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小 时内方便、快捷地将微量 DNA（含由 RNA 反转录成的微量 DNA）扩增达 106 倍，得到 ug 级的 DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热 DNA 聚合酶， 使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的 作用。 DDPCR 技术是九十年代以来，建立在 PCR 技术之上发展起来的新技术。DDPCR 是 Differential display PCR 的缩写，有人译作“差异展示 PCR”或作“异呈 PCR”。这一技术主要 用于快速呈现两个或两个以上细胞系或组织基因转录的差异，并快速扩增那些不同转录的基 因片段。 PCR 的原理是选用两段引物，分别与拟扩增的模板 DNA 两条链上各一段序列互补，且 分别位于模板 DNA 中拟扩增 DNA 片段两条链的 3'端。加热使模板 DNA 变性，降温时，两 段引物分别与靶序列发生退火，然后两引物在 DNA 聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过 量的两段引物和 4 种 dNTP 的反应体中，位于两段引物间的 DNA 在反复变性、退火、延伸 的循环里，每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过 30-40 个 循环，目的 DNA 可由原来的 1pg 扩增到 1ug。 DDPCR 的原理是取无 DNA 污染的总 RNA，分别加入三个锚引物，H-T11 -C、H-T11 -G 和 H-T11 -A，三个引物的 11 个 T（胸苷）选择性地结合到 mRNA 的 A（腺苷）尾上，在反 转录酶的作用下，将所有的 mRNA 反转录成 cDNA。再以这一含 cDNA 的反应液为模板，分 别加入以上三个锚引物，和若干随机引物，如 AAGCTTGATTGCC，AAGCTTCGACTGT 等， PCR 放大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有 cDNA，反应体中加入α[ 33P]dATP 或α[ 35S]dATP。把两个或两个以上细胞系或组织锚引物与随机引物相一致的 PCR 产物相邻 上样于变性测序凝胶上，电泳，放射自显影，曝光。两个或两个以上细胞系或组织相同 mRNA 所反转录的 cDNA 在 X 片上会出现并列的显影条带，而不同 mRNA 所反转录的 cDNA 会出 现独特的显影条带。 目前 RT-PCR（反转录 PCR）技术使用得十分频繁，在判断、比较不同组别某一 mRNA 转录与否或转录多少等方面十分便捷，与 Northern blot 相比，程序简单、快，但灵敏度差些， 重复性亦差些，对 mRNA 提取质量要求高。其原理是先用寡聚胸苷作为引物，反转录所有 mRNA 成 cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物，PCR 扩增该段 cDNA。为校正样本 RNA 含量组间可能存在的误差，通常在同一试管内一并扩增β肌动蛋白的 cDNA。上样电泳，并 染色后，拍照，激光光密度计扫描定量，用β肌动蛋白校正拟扩增的基因片段灰度值，统计 分析。此外，还有原位 PCR 等等由 PCR 演变而来的技术