性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途？ ①利用Ecoli DNA聚合酶的.3外切核酸酶活性，可用切口平移法标记DNA,所有DNA聚合酶中只有 此酶有此反应：②用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性：③对3突出端的DNA作末端标 记（交换或置换反应）. 10.用T4 phage DNA polymerase可进行末端标记，试简述其原理？ T4 phage DNA聚合酶具有3-了外切活性和5-3的聚合酶活性，3-的外切活性可以被5-3的聚合活性 所封闭，首先在反应体系中加入一种NTP,产生3凹端，然后加入经过标记的dNTP,利 用T4 phage DNA聚合酶的聚合活性补平3y凹端，即可得到标记了术端的DNA片断。 1L.BAP和CIAP有何作用？为何一般采用CIAP而不采用BAP? 作用：催化除去DNA或RNA了磷酸。BAP抗性强，抗高温和去污剂。CIAP可用蛋白酶K消化灭活，或 在5 nM EDTA下，65℃处理或75℃处理I0分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的DNA,从而去 除CIAP的活性.相比之下，CIAP比BAP更易去除，因此，一般采用CIAP 12依于DNA的RNA聚合酶句括S6做菌体RNA聚合酶和T4或T门噬菌体RNA聚合 酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？ ①将T7RNA聚合酶基因置于E.colilacUV巧启动子之下，插入到入噬菌体中，感染E.coli,建立稳定的溶 菌，Ecoli BL21(DE3)菌株即为将1aUV5启动子和T7聚合酶基因置于1噬菌体DE3区，该入.噬菌 体DNA整合于染色体的BL21处。若将T噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中。 在PTG诱导下，可启动外颜基因的表达：②先导入带T7噬荫体启动子控制的目的基因的质粒，再用入噬 南体（带T7RNA聚合酶基因）感染E.coli,激活目的基因的表达。 13.简述T4多核苷酸激酶的活性和用途？ T4多核苷酸盖酶的活性催化ATP的Y一磷酸基转移到DNA或RNA的S末端。可表现为两种反应，正反应 指ATP的Y一酸基被转移到去磷酸化的DNA了端，用于对缺乏5”一磷酸的DNA进行磷酸化。在交换反 应中，过量的AP可使该激酶将碳酸化的5瑞磷酸转移给ADP,然后DNA从【y一32P】AP中获得放射 性标记的？一磷酸而重新磷酸化，因此可用于DN的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏了一酶 的DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记末端，以供Mxam 一Gct法测序、S】核酸酶分析以及其它须使用末端标记DNA的步骤. 14.限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？ 生要特性 1型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结物 异源三凝体 同源三取体 异源二聚体 铺助子 ATP Mg2 SAM ATP Ma2 SAM 识别序列 TGAN TGCT 隆转对称序列 GAGCO AACN.GTGO CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割 特异性切期■ 24-26bp处性，试根据此推测该聚合酶可能具有哪些用途? ①利用 E.coli DNA 聚合酶 的 5'-3' 外切核酸酶活性，可用切口平移法标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有 此酶有此反应；②用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性；③对 3' 突出端的 DNA 作末端标 记（交换或置换反应）。 10. 用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？ T4 phage DNA 聚合酶具有 3'-5' 外切活性和 5'-3' 的聚合酶活性，3'-5' 的外切活性可以被 5'-3' 的聚合活性 所封闭，首先在反应体系中加入一种 dNTP ，产生 3' 凹 端 ， 然 后 加 入 经 过 标 记 的 dNTP ， 利 用 T4 phage DNA聚合酶的聚合活性补平 3' 凹端，即可得到标记了末端的 DNA 片断。 11. BAP 和 CIAP 有何作用？为何一般采用 CIAP 而不采用 BAP ？ 作用：催化除去 DNA 或 RNA 5' 磷酸。BAP 抗性强，抗高温和去污剂。 CIAP 可用蛋白酶 K 消化灭活，或 在 5mM EDTA 下，65℃ 处理或 75℃ 处理 10 分钟，然后用酚氯仿抽提，纯化去磷酸化的 DNA ，从而去 除 CIAP 的活性。相比之下， CIAP 比 BAP 更易去除，因此，一般采用 CIAP 12. 依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶包括 SP6 噬菌体 RNA 聚合酶和 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合 酶，这类聚合酶可用于表达外源基因，阐述常用的构建策略？ ①将 T7 RNA 聚合酶基因置于 E.coli lacUV5 启动子之下，插入到 λ 噬菌体中，感染 E.coli ，建立稳定的溶 源菌。 E.coli BL21（DE3）菌株即为将 lacUV5 启动子和 T7 聚合酶基因置于 λ 噬菌体 DE3 区，该 λ 噬菌 体 DNA 整合于染色体的 BL21 处。若将 T7 噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中， 在 IPTG 诱导下，可启动外源基因的表达；②先导入带 T7 噬菌体启动子控制的目的基因的质粒，再用 λ 噬 菌体（带 T7 RNA 聚合酶基因）感染 E.coli ，激活目的基因的表达。 13. 简述 T4 多核苷酸激酶的活性和用途？ T4 多核苷酸激酶的活性催化 ATP 的 γ－磷酸基转移到 DNA 或 RNA 的 5' 末端。可表现为两种反应，正反应 指ATP 的 γ－磷酸基被转移到去磷酸化的 DNA 5' 端，用于对缺乏 5'－磷酸的 DNA 进行磷酸化。在交换反 应中，过量的 ATP 可使该激酶将磷酸化的 5' 端磷酸转移给 ADP ，然后 DNA 从【γ－32P】ATP 中获得放射 性标记的 γ－磷酸而重新磷酸化，因此可用于 DNA 的末端标记。用途：该酶主要用于对缺乏 5'－磷酸 的 DNA 或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。通过交换反应，用于标记 5' 末端，以供 Maxam －Gilbert 法测序、 S1 核酸酶分析以及其它须使用末端标记 DNA的步骤。 14. 限制性内切酶可划分为哪几个类型，各自有何特点？