限制酶切制D八A时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量 的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切制活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另如3一4个碱 基。 3.试回答影响限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)切割效率的因素？ 外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性：内因：位点偏爱性：甲基化：底物的 构象。 4.在酶切缓冲液中，一般需加入BSA,请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？ 作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用，限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA是 一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。 5.何谓Star activity?简述Star activity的影响因素及克服方法 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活 性的的因素：①高甘油浓度(>5%)：②南过量(>100Um1):®低离子强度(<25mM):④高pH(>8.0 ⑤有机溶剂如PMSD(二甲基亚砜)、入乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(),二甲基甲酰鞍 (dimethylformamide)和sulphalane等：⑥用其它二价阳高子Mn2+、C2+、Co2+或Zn2+代替Mg2+, 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，免过量切，减少甘油浓度：②保证反应体系中无有机溶剂或 乙醇：③提高离子强度到100~150mM(在不抑制酶活性的前提下)：④降低反应pH至7.0：⑤使用Mg2+作 为二价阳离子。 6.某DNA序列中存在Dpl酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用 该酶进行酶切时，发现切制不动，试分析可能原因？ 生物体内的DNA序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化 的限制酶Dpl来切制非甲基化的序列时，就会出现不能切制的情况 7.天然的质粒载体(plasmid vectors)通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段， 引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？ 在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的了突出端补平后，再连接以产生新的酶切 位点：②同尾末端的连接，不同的同尾酶切制D小A产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同 时原来的酶切位点却消失：③平末端的连接 8.双脱氧终止法测定DNA序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片 段的DNA序列？ ①将所需要测序的DNA片断采用2种不同的限制性内切酶切制，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接 到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的DNA序列：②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与 找体连接后，测序，拼接，即可得到全长DN八片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分 酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的南切片断能覆盖所需测序的DNA片断 9.大肠杆菌DNA聚合酶I,具有3-5外切活性和5-3的聚合酶活性以及5父3的外切活 限制酶切割 DNA 时对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量 的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。因此，一般需在设计引物时在限制酶切位点外另加 3～4 个碱 基。 3. 试回答影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素？ 外因：反应条件、底物纯度、反应温度和限制性内切酶本身的活性；内因：位点偏爱性；甲基化；底物的 构象。 4. 在酶切缓冲液中，一般需加入 BSA，请问加入 BSA 的作用是什么？并简述其原理？ 作用是提供一定的蛋白质浓度，起保护限制性内切酶的作用。限制性内切酶在稀释液中会迅速变性，BSA 是 一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质。 5. 何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？ 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。引起星星活 性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/ml）；③低离子强度（<25mM）；④高 pH (>8.0)； ⑤有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺 （dimethylformamide）和 sulphalane 等；⑥用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或 乙醇；③提高离子强度到 100～150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应 pH 至 7.0 ；⑤使用 Mg2+ 作 为二价阳离子。 6. 某 DNA 序列中存在 DpnI 酶切位点，以此 DNA 为模板，在体外合成 DNA 序列，当用 该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？ 生物体内的 DNA 序列可能是经过甲基化修饰的，而在体外合成时，缺乏这种修饰作用。当用依赖于甲基化 的限制酶 DpnI 来切割非甲基化的序列时，就会出现不能切割的情况。 7. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段， 引入多克隆位点等。试问在此过程中如何增减酶切位点？ 在酶切水平上，通过酶切和连接产生新的酶切位点。①将产生的 5' 突出端补平后，再连接以产生新的酶切 位点；②同尾末端的连接，不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端，再相互连接时，可产生新的酶切位点，同 时原来的酶切位点却消失；③平末端的连接 8. 双脱氧终止法测定 DNA 序列的片段一般不能太长，如何运用本章所学知识测定较长片 段的 DNA 序列？ ①将所需要测序的 DNA 片断采用 2 种不同的限制性内切酶切割，产生不同的酶切片段，将此酶切片段连接 到载体上，测序后，拼接，即可得到全长的 DNA 序列；②用一种限制性内切酶进行部分酶切，酶切产物与 载体连接后，测序，拼接，即可得到全长 DNA 片断。采用以上任一方法均可，需要注意的是，在进行部分 酶切时，应该控制好条件，要确保所得到的酶切片断能覆盖所需测序的 DNA 片断。 9. 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，具有 3'-5’外切活性和 5'-3' 的聚合酶活性以及 5'-3' 的外切活