张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 1271 杉醇的联合用药组(TF)。分别以MTT法、流式细胞术检测高糖DMEM完全培养液中(含10%胎牛血清,100 细胞增殖情况以及细胞周期、细胞凋亡等指标的变化,荧u/mL青霉素,100u/mL链霉素),经0.25%胰蛋白 光显微镜观察细胞核形态的改变, Western blot检测酶溶液消化传代,在37℃、饱和湿度、含5%CO2的 Survivin、PARP蛋白及细胞外信号调节激酶(ERK)的表 达。结果:TSA明显增强了紫杉醇对两种肺癌细胞的抑制 培养箱中进行培养。 率。紫杉醇作用96h对H322轴胞的IC由(40726.12)1.2.2MT实验取对数生长期的细胞,以1 md/L下降至(634±5.72)moM/L,对H299细胞的IC10/孔接种于96孔板中,培养过夜后将两种细胞 由(110.6±387)mol/L下降至(63.7±11.8)mol/L,差异分为紫杉醇96h组(TAX)、TSA12h组(TSA)和 具有统计学意义(P<0.05)。TF组H322细胞凋亡率较 TAX TSA作用12h再加紫杉醇84h组(TF),12h时换 组明显增加(P005);各组H199胞出现少量调亡细培养液。联合用药时TSA浓度为300mmol/L,紫杉 胞,T组的死亡细胞明显多于其他组。TAX上调H322细醇浓度梯度为0.001.001、0.1、1、10、100、100 胞中pERK的表达,TSA及TF减低两种细胞中pERK表 达;TAX明显增加 Survivin的表达,TsA及TF下调了 nmol/L;变换用药时,以吸管吸出原培养液,PBS Survivin的表达。TAX组和TF组H322细胞中均检测到剪缓冲液200μL洗涤一次,再加入相应浓度的药 切PARP蛋白,TF组较TAX组剪切PARP蛋白明显增加,物。TSA浓度梯度为1875、37.5、75、150、300、600 而H1299细胞各组均未检测到剪切PARP蛋白。结论:1200mmol/L;12h时换为空白培养液。每组设3 HDAC抑制剂TSA联合紫杉醇可以协同抑制H322及个复孔,同时设正常和空白对照组。置96孔板于 H299细胞增殖,促进H322细胞凋亡和H1299细胞死亡。培养箱中共培养96h。按常规方法依次加入MTT 协同机制可能与通过下调肺癌细胞由紫杉醇诱发的溶液、裂解液,振荡后测吸光度值(A值)。并按下 Survivin高表达和阻断ERK通路的激活有关。 关键词:肺癌;组蛋白去乙酰化酶;曲古抑菌素A;紫杉 式计算细胞存活率:存活率=(处理组A值/阴性 醇;细胞凋亡;细胞外信号通路激酶 对照组A值)×100%。采用曲线回归模型拟合其量 中图分类号:R73-3 文献标识码:A 效关系,得到各时段TSA作用的半数抑制浓度 文章编号:1000-467X(2009)12-1270-07 (ICs)。实验重复3次。 1.2.3流式细胞仪分析细胞周期及检测凋亡率 组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylas 取对数生长期的细胞,以1×10/孔接种于6孔板 HDAC)抑制剂是一类新型的、对多种肿瘤具有抑制中,当细胞生长至60%密度时,分为正常对照组 功能的制剂,通过抑制多种基因或蛋白介导的信号紫杉醇24h组(TAX)、TSA12h组(TSA)、TSA作 转导网络的功能,影响细胞的增殖及对化疗药物的用12h再加紫杉醇24h组(TF)4组。12h时换培 敏感性。HDAC抑制剂的诸多功能使其联合其他治养液。TSA用药浓度为300mmol/L,紫杉醇用药浓 疗方法成为新的治疗思路。我们检测HDAC抑制剂度为10mmo/L。按分组时间到期时分别用0.25% SA联合紫杉醇对肺癌细胞的协同抑制作用,期望胰蛋白酶溶液消化收集细胞,1000r/min离心10 为临床应用提供理论基础。 min,PBS洗2次,重悬细胞于0.6mL的PBs液(含 1材料与方法 I%胎牛血清),加入1.4mL冷乙醇,混匀固定, 20℃保存。检测当天离心,PBS液洗2次,重悬细 1.1材料 胞于0.5mL的PBS,加入5μ L RNase,37℃水浴 人肺癌细胞株H322、HI299由军事医学科学30min,再加1mg/mL碘化丙啶(PI)50μL,避光 院惠赠。四甲基偶氮唑蓝(MT)、二甲基亚砜室温20min,上机检测。实验重复3次 (DMSO)均为 sigma公司产品;兔抗人总ERK多克1.24荧光显微镜观察细胞核形态变化取对数生 隆抗体、鼠抗人磷酸化ERK(pERK)多克隆抗体、长期细胞接种于6孔培养板,每孔加入1×10°个细 鼠抗人PARP单克隆抗体、鼠抗人β- actin单克隆胞,培养液2m,按123的分组,分组时间到期后 抗体、鼠抗人 Survivin单克隆抗体为美国Cell按1:1000的终浓度加入 Hoechst33342,于37℃C、饱 Signaling公司产品;BCA蛋白测定试剂盒为美国和湿度、含5%CO2的培养箱中反应20min,荧光显 Pierce公司产品;紫杉醇为美国 Sigma公司产品;微镜下紫外光激发 Hoechst3332呈蓝色,20倍显微 ISA为美国 Calbiochem公司产品 镜下观察拍照,同时摄取普通光镜下照片。 1.2方法 12.5 Western blot检测蛋白表达总细胞外信号 1.2.1细胞培养H322、HI299细胞常规培养于调节激酶及其磷酸化蛋白( total and phosphorylation张 东!等! 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶 !"#$%&’( )*+,*%-.+$*" /012#抑制剂是一类新型的$对多种肿瘤具有抑制 功能的制剂"通过抑制多种基因或蛋白介导的信号 转导网络的功能"影响细胞的增殖及对化疗药物的 敏感性% 3012 抑制剂的诸多功能使其联合其他治 疗方法成为新的治疗思路% 我们检测 3012 抑制剂 451 联合紫杉醇对肺癌细胞的协同抑制作用" 期望 为临床应用提供理论基础% ! 材料与方法 !"! 材料 人肺癌细胞株 3678$398:: 由军事医学科学 院惠赠% 四甲基偶氮唑蓝 &;44#$ 二 甲 基 亚 砜 &0;5<#均为 5#=>? 公司产品’兔抗人总 @AB 多克 隆抗体$鼠抗人磷酸化 @AB&C@AB#多克隆抗体$ 鼠抗人 D1AD 单克隆抗体$ 鼠抗人 !E?,%#’ 单克隆 抗 体 $ 鼠 抗 人 5FGH#H#’ 单 克 隆 抗 体 为 美 国 2*.. 5#=’?.#’= 公司产品’I21 蛋白测定试剂盒为美 国 D#*G,* 公司产品’ 紫杉醇为美国 5#=>? 公司产品’ 451 为美国 2?.I#&,"*> 公司产品% !"# 方法 JK7KJ 细胞培养 3677$3J7:: 细胞常规培养于 高糖 0;@; 完全培养液中 &含 JLM胎牛血清"9LL F N >O 青霉素"9LL F N >O 链霉素#"经 LP8QM胰蛋白 酶溶液消化传代"在 RST$饱和湿度$含 QU V<7 的 培养箱中进行培养% JK7K7 ;44 实验 取对数生长期的细胞" 以 JW JLX N 孔接种于 YZ 孔板中" 培养过夜后将两种细胞 分为紫杉醇 YZ " 组&4[\#$45[ J7 " 组&45[#和 45[ 作用 J7 " 再加紫杉醇 ]X " 组&4^#"J7 " 时换 培养液% 联合用药时 45[ 浓度为 6__ ’>&. ‘ O"紫杉 醇 浓 度 梯 度 为 _K__J$_K_J$_KJ$J$J_$J__$J___ ’>&. ‘ O’变 换 用 药 时 "以 吸 管 吸 出 原 培 养 液 "DI5 缓冲液 7__ "O 洗涤一次" 再加入相应浓度的药 物%451 浓度梯度为 J]Kab$6aKb$ab$Jb_$6__$Z__$ J 7__ ’>&. ‘ O’J7 " 时换为空白培养液% 每组设 6 个复孔"同时设正常和空白对照组% 置 :Z 孔板于 培养箱中共培养 :Z "% 按常规方法依次加入 ;44 溶液$裂解液"振荡后测吸光度值&! 值# % 并按下 式计算细胞存活率(存活率c!处理组 ! 值 ‘ 阴性 对照组 ! 值)WJ__U%采用曲线回归模型拟合其量 效关系" 得到各 时 段 451 作 用 的 半 数 抑 制 浓 度 !d2b_)% 实验重复 6 次% JK7K6 流式细胞仪分析细胞周期及检测凋亡率 取对数生长期的细胞" 以 JWJ_X ‘ 孔接种于 Z 孔板 中"当细胞生长至 Z_U密度时"分为正常对照组$ 紫杉醇 7X " 组!41\)$451 J7 " 组!451)$451 作 用 J7 " 再加紫杉醇 7X " 组!4^)X 组% J7 " 时换培 养液% 451 用药浓度为 6__ ’>&. ‘ O"紫杉醇用药浓 度为 J_ ’>&. ‘ O% 按分组时间到期时分别用 _K7bU 胰蛋白酶溶液消化收集细胞"J ___ G ‘ >#’ 离心 J_ >#’"DI5 洗 7 次"重悬细胞于 _KZ >O 的 DI5 液!含 JU胎 牛 血 清) "加 入 JKX >O 冷 乙 醇"混 匀 固 定 " e7LT保存% 检测当天离心"DI5 液洗 7 次"重悬细 胞于 LPb >O 的 DI5" 加入 b "O Af?$*"6aT水浴 6_ >#’"再加 J >= ‘ >O 碘化丙啶!Dd)b_ "O"避光" 室温 7_ >#’"上机检测% 实验重复 6 次% JK7KX 荧光显微镜观察细胞核形态变化 取对数生 长期细胞接种于 Z 孔培养板" 每孔加入 JWJ_b 个细 胞"培养液 7 >O"按 JK7K6 的分组"分组时间到期后" 按 JgJ LLL 的终浓度加入 3&*,"$%666X7"于 6ST$饱 和湿度$含 bU 2<7 的培养箱中反应 7L >#’"荧光显 微镜下紫外光激发 3&*,"$%666X7 呈蓝色"7L 倍显微 镜下观察拍照"同时摄取普通光镜下照片% JP7Pb h*$%*G’ i.&% 检测蛋白表达 总细胞外信号 调节激酶及其磷酸化蛋白!%&%?. ?’) C"&$C"&G-.?%#&’ 杉醇的联合用药组!4^)% 分别以 ;44 法$流式细胞术检测 细胞增殖情况以及细胞周期$ 细胞凋亡等指标的变化"荧 光 显 微 镜 观 察 细 胞 核 形 态 的 改 变 "h*$%*G’ i.&% 检 测 5FGH#H#’$D1AD 蛋 白 及 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 !@AB) 的 表 达% 结果!451 明显增强了紫杉醇对两种肺癌细胞的抑制 率%紫杉醇作用 :Z " 对 3677 细胞的 d2bL 由!XjPLak7ZKJ7) ’>&. ‘ O 下 降 至 !ZK6X kbKS7)’>&. ‘ O" 对 3J7:: 细 胞 的 d2b_ 由 !JJ_KZ k6jKS)’>&. ‘ O 下 降 至 !Z6KS kJJKj)’>&. ‘ O" 差 异 具有统计学意义!"l_K_b)% 4^ 组 3677 细胞凋亡率较 41\ 组明显增加 !"l_K_b)’ 各组 3J7:: 细胞出现少量凋亡细 胞 "4^ 组的死亡细胞明显多于其他组% 41\ 上调 3677 细 胞 中 C@AB 的 表 达 "451 及 4^ 减 低 两 种 细 胞 中 C@AB 表 达 ’41\ 明 显 增 加 5FGH#H#’ 的 表 达 "451 及 4^ 下 调 了 5FGH#H#’ 的表达% 41\ 组和 4^ 组 3677 细胞中均检测到剪 切 D1AD 蛋白 "4^ 组较 41\ 组剪切 D1AD 蛋白明显增加" 而 3J7:: 细 胞 各 组 均 未 检 测 到 剪 切 D1AD 蛋 白 % 结 论 ! 3012 抑 制 剂 451 联 合 紫 杉 醇 可 以 协 同 抑 制 3677 及 3J7:: 细胞增殖"促进 3677 细胞凋亡和 3J7:: 细胞死亡% 协 同 机 制 可 能 与 通 过 下 调 肺 癌 细 胞 由 紫 杉 醇 诱 发 的 5FGH#H#’ 高表达和阻断 @AB 通路的激活有关% 关键词 !肺癌’ 组蛋白去乙酰化酶’ 曲古抑菌素 1’ 紫 杉 醇’ 细胞凋亡’ 细胞外信号通路激酶 中图分类号!AS6E6 文献标识码!1 文章编号!J___mXnS\!7__:)J7mJ7S_m_S !"#! C M Y K