《癌症》（基础研究）：组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制.pdf_大学文库

1270 《癌症》 Chinese Journal of Cancer,2009,28(12):1270-12 基础研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制张东1,刘长庭1,于晓妉2,刘岩 Synergistic cytotoxicity effect of histone deacetylase inhibitor combined with paclitaxel on lung cancer cell lines and its mechanism Dong Zhang, ' Chang-Ting Liu, Xiao-Dan Yu? and Yan Liu' [ Abstract] Background and Objective: Histone deacetylase (HDAC inhibitors can inhibit cell signal network function through decreasing expression of multiple genes and proteins, thus affect cell proliferation survival and chemosensitivity. HDAC inhibitors combined with paclitaxel may enhance the inhibitory effect of drugs on lung cancer cells. This study was to observe the synergistic anti-proliferative effect of HDAC inhibitor trichostatin A (TSA) combined with paclitaxel on lung cancer cell lines H322 and H1299 1.解放军总医院南楼 and to investigate its mechanism. Methods: H322 and H1299 cells were 呼吸科 divided into control group, paclitaxel (TAX) group, TSa group, and 北京100853 combination group(TF group, TSa followed by paclitaxel ). Cell proliferation 2.解放军军事医学科学院 was determined by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were determined by 基础所 flow cytometry. The protein expression levels of survivin, ERK, and PARP 北京100850 were determined by Western blot analysis. Results: When combined with TSA, the 50% inhibition concentration (ICso) of paclitaxel decreased from 1. Geriatric Respiratory (48.07*26. 12) nmol/L to (6.34+5.72) nmol/L in H322 cells and from (110.6+38.7)nmol/L to(63.7+11.8)nmol/L in H1299 cells, with significant differences(P<0.05). Apoptosis rate of H322 cells was higher in the the TF group than in the TAX group(P<0. 05). There were more necrosis cells in the P R. China TF group of H1299 cell line than in the other groups. pERK was up-regulated 2. Institute of Basic Medical in the TAx group of H322 cell line. Expression of Survivin was up-regulated in the TaX group of two cells. Expressions of Survivin and pERK were down- Academy of Military Medical regulated in the TSA and tF groups of two cell lines. Cleaved PARP was Science, Beijing 100850 detected in the TAX and the tF groups of H322 cells, and its expression P R. China was significantly higher in the the tF group than in the TAx group. Cleaved PARP was not detected in each group of H1299 cells. Conclusions: TSA 通讯作者:张东 combined with paclitaxel has a synergistic cytotoxicity effect on lung cancer Correspondence to: Dong Zhang cell lines H322 and H1299 when the cells were treated with TSA followed by Tel.:86.013521291696 paclitaxel. The mechanism may be that TSA down-regulates the survivin high- gd1117@yahoo.com expression induced by paclitaxel, and blocks pERK protein expression Key words: lung cancer, histone deacetylase, trichostatin A, paclitaxel 基金项目:军队“十一五”面上课 apoptosis, ERK 题B类【摘要】背景与目的:组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylase,HDAC)抑制剂 Grant: Army "1lth Five-Year 通过抑制多种基因或蛋白介导的信号转导网络的功能,影响细胞增殖及对化疗 Plan"Surface Project Class B 药物的敏感性。HDAC抑制剂可能会提高紫杉醇对肺癌细胞的抑制作用。本研究评价HDAC抑制剂曲古抑菌素A( trichostatin A,TSA)协同紫杉醇抑制肺癌细胞收稿日期:2009-06-10 H322及H299的作用及机制。方法:将H322和H1299细胞分别分成4组:(1) 修回日期:2009-08-07 对照组;(2)紫杉醇组(TAX):(3)TSA组;(4)以TSA预先作用12h后,再使用紫

!癌症" !"#$%&% ’()*$+, (- .+$/%*# 0112# 03$40%&506784069 !基础研究! !!"#$%&’$" (&’)*%+,-. &-. /"01’$231# !"#$%&’ ()*+)$,-*#) $./01% "&2"3"$%4# +5& "&2"6"$ +)-- #"7&5- &)$8%49 :;&4’##"%& %: ?;-$">-’ 7’&’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‘JaOKJ% &?%- b c $% $aOI] ‘XO_J% &?%- b c "& .IJJ +)--# 5&( :4%? $KKYOa‘I^O_% &?%- b c $% $aIO_‘KKO^% &?%- b c "& .KJLL +)--#& 8"$2 #"7&":"+5&$ ("::)4)&+)# $!dYOYX%O 0>%>$%#"# 45$) %: .IJJ +)--# 85# 2"72)4 "& $2) $2) EN 74%;> $25& "& $2) E0M 74%;>$!dYOYX%O E2)4) 8)4) ?%4) &)+4%#"# +)--# "& $2) EN 74%;> %: .KJLL +)-- -"&) $25& "& $2) %$2)4 74%;>#O >QeS 85# ;>F4)7;-5$)( "& $2) E0M 74%;> %: .IJJ +)-- -"&)O Q=>4)##"%& %: H;4A"A"& 85# ;>F4)7;-5$)( "& $2) E0M 74%;> %: $8% +)--#O Q=>4)##"%&# %: H;4A"A"& 5&( >QeS 8)4) (%8&F 4)7;-5$)( "& $2) EH0 5&( EN 74%;># %: $8% +)-- -"&)#O D-)5A)( fGef 85# ()$)+$)( "& $2) EGM 5&( $2) EN 74%;># %: .IJJ +)--#& 5&( "$# )=>4)##"%& 85# #"7&":"+5&$-, 2"72)4 "& $2) $2) EN 74%;> $25& "& $2) EGM 74%;>O D-)5A)( fGef 85# &%$ ()$)+$)( "& )5+2 74%;> %: .KJLL +)--#O 8+-’7,#2+-## EHG +%?6"&)( 8"$2 >5+-"$5=)- 25# 5 #,&)47"#$"+ +,$%$%="+"$, )::)+$ %& -;&7 +5&+)4 +)-- -"&)# .IJJ 5&( .KJLL 82)& $2) +)--# 8)4) $4)5$)( 8"$2 EHG :%--%8)( 6, >5+-"$5=)-O E2) ?)+25&"#? ?5, 6) $25$ EHG (%8&F4)7;-5$)# $2) #;4A"A"& 2"72F )=>4)##"%& "&(;+)( 6, >5+-"$5=)-& 5&( 6-%+9# >QeS >4%$)"& )=>4)##"%&O 91: ;+%.## -;&7 +5&+)4& 2"#$%&) ()5+)$,-5#)& $4"+2%#$5$"& G& >5+-"$5=)-& 5>%>$%#"#& QeS !摘要" 背景与目的#组蛋白去乙酰化酶$"#&:($% ;%+/%:?.%抑制剂通过抑制多种基因或蛋白介导的信号转导网络的功能& 影响细胞增殖及对化疗药物的敏感性’ =>?. 抑制剂可能会提高紫杉醇对肺癌细胞的抑制作用’ 本研究评价 =>?. 抑制剂曲古抑菌素 ?$:*#/"(&:+:#$ ?& @A?%协同紫杉醇抑制肺癌细胞 =B00 及 =5022 的作用及机制’ 方法#将 =B00 和 =5022 细胞分别分成 C 组#$5% 对照组($0%紫杉醇组$@?D%($B%@A? 组($C%以 @A? 预先作用 50 " 后&再使用紫组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制张东 5 " 刘长庭 5 " 于晓妉 0 " 刘岩 5 >1’$ +> 52#$+-1 .1&’1$:7&#1 2-52"2$+% ’+?"2-1. ;2$5 @&’72$&=17 +- 7,-* ’&-’1% ’177 72-1# &-. 2$# ?1’5&-2#? /%&7 g2*&7&K D2*&7FE"&7 c";&K M"*%F/*& h;J *&( h*& c";K 5E 解放军总医院南楼呼吸科" 北京 4773FB 0G 解放军军事医学科学院基础所" 北京 4773F7 !" #$%&’(%&) *$+,&%’(-%. /$,’%(0$1(" 234 #$1$%’5 6-+,&(’5" 7$&8&19 !::;?&1’ @" A1+(&(B($ -C 7’+&) D$E&)’5 F)&$1)$+" 4)’E$0. -C D&5&(’%. D$E&)’5 F)&$1)$" 7$&8&19 !::;?&1’ 通讯作者# 张东 .(**%&H($;%$/% :(# I($J K"+$J @%,G# 39G74BF04024929 LM+#,# N"+$J;5556O<+"((G/(M 基金项目 #军队 $十一五 %面上课题 P 类 !"#$%# ?*M< $55:" Q#R%ST%+* U,+$% A)*-+/% U*(V%/: .,+&& P 收稿日期#0772S79S57 修回日期#0772S73S76 !"#$ C M Y K

张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 1271 杉醇的联合用药组(TF)。分别以MTT法、流式细胞术检测高糖DMEM完全培养液中(含10%胎牛血清,100 细胞增殖情况以及细胞周期、细胞凋亡等指标的变化,荧u/mL青霉素,100u/mL链霉素),经0.25%胰蛋白光显微镜观察细胞核形态的改变, Western blot检测酶溶液消化传代,在37℃、饱和湿度、含5%CO2的 Survivin、PARP蛋白及细胞外信号调节激酶(ERK)的表达。结果:TSA明显增强了紫杉醇对两种肺癌细胞的抑制培养箱中进行培养。率。紫杉醇作用96h对H322轴胞的IC由(40726.12)1.2.2MT实验取对数生长期的细胞,以1 md/L下降至(634±5.72)moM/L,对H299细胞的IC10/孔接种于96孔板中,培养过夜后将两种细胞由(110.6±387)mol/L下降至(63.7±11.8)mol/L,差异分为紫杉醇96h组(TAX)、TSA12h组(TSA)和具有统计学意义(P<0.05)。TF组H322细胞凋亡率较 TAX TSA作用12h再加紫杉醇84h组(TF),12h时换组明显增加(P005);各组H199胞出现少量调亡细培养液。联合用药时TSA浓度为300mmol/L,紫杉胞,T组的死亡细胞明显多于其他组。TAX上调H322细醇浓度梯度为0.001.001、0.1、1、10、100、100 胞中pERK的表达,TSA及TF减低两种细胞中pERK表达;TAX明显增加 Survivin的表达,TsA及TF下调了 nmol/L;变换用药时,以吸管吸出原培养液,PBS Survivin的表达。TAX组和TF组H322细胞中均检测到剪缓冲液200μL洗涤一次,再加入相应浓度的药切PARP蛋白,TF组较TAX组剪切PARP蛋白明显增加,物。TSA浓度梯度为1875、37.5、75、150、300、600 而H1299细胞各组均未检测到剪切PARP蛋白。结论:1200mmol/L;12h时换为空白培养液。每组设3 HDAC抑制剂TSA联合紫杉醇可以协同抑制H322及个复孔,同时设正常和空白对照组。置96孔板于 H299细胞增殖,促进H322细胞凋亡和H1299细胞死亡。培养箱中共培养96h。按常规方法依次加入MTT 协同机制可能与通过下调肺癌细胞由紫杉醇诱发的溶液、裂解液,振荡后测吸光度值(A值)。并按下 Survivin高表达和阻断ERK通路的激活有关。关键词:肺癌;组蛋白去乙酰化酶;曲古抑菌素A;紫杉式计算细胞存活率:存活率=(处理组A值/阴性醇;细胞凋亡;细胞外信号通路激酶对照组A值)×100%。采用曲线回归模型拟合其量中图分类号:R73-3 文献标识码:A 效关系,得到各时段TSA作用的半数抑制浓度文章编号:1000-467X(2009)12-1270-07 (ICs)。实验重复3次。 1.2.3流式细胞仪分析细胞周期及检测凋亡率组蛋白去乙酰化酶( histone deacetylas 取对数生长期的细胞,以1×10/孔接种于6孔板 HDAC)抑制剂是一类新型的、对多种肿瘤具有抑制中,当细胞生长至60%密度时,分为正常对照组功能的制剂,通过抑制多种基因或蛋白介导的信号紫杉醇24h组(TAX)、TSA12h组(TSA)、TSA作转导网络的功能,影响细胞的增殖及对化疗药物的用12h再加紫杉醇24h组(TF)4组。12h时换培敏感性。HDAC抑制剂的诸多功能使其联合其他治养液。TSA用药浓度为300mmol/L,紫杉醇用药浓疗方法成为新的治疗思路。我们检测HDAC抑制剂度为10mmo/L。按分组时间到期时分别用0.25% SA联合紫杉醇对肺癌细胞的协同抑制作用,期望胰蛋白酶溶液消化收集细胞,1000r/min离心10 为临床应用提供理论基础。 min,PBS洗2次,重悬细胞于0.6mL的PBs液(含 1材料与方法 I%胎牛血清),加入1.4mL冷乙醇,混匀固定, 20℃保存。检测当天离心,PBS液洗2次,重悬细 1.1材料胞于0.5mL的PBS,加入5μ L RNase,37℃水浴人肺癌细胞株H322、HI299由军事医学科学30min,再加1mg/mL碘化丙啶(PI)50μL,避光院惠赠。四甲基偶氮唑蓝(MT)、二甲基亚砜室温20min,上机检测。实验重复3次 (DMSO)均为 sigma公司产品;兔抗人总ERK多克1.24荧光显微镜观察细胞核形态变化取对数生隆抗体、鼠抗人磷酸化ERK(pERK)多克隆抗体、长期细胞接种于6孔培养板,每孔加入1×10°个细鼠抗人PARP单克隆抗体、鼠抗人β- actin单克隆胞,培养液2m,按123的分组,分组时间到期后抗体、鼠抗人 Survivin单克隆抗体为美国Cell按1:1000的终浓度加入 Hoechst33342,于37℃C、饱 Signaling公司产品;BCA蛋白测定试剂盒为美国和湿度、含5%CO2的培养箱中反应20min,荧光显 Pierce公司产品;紫杉醇为美国 Sigma公司产品;微镜下紫外光激发 Hoechst3332呈蓝色,20倍显微 ISA为美国 Calbiochem公司产品镜下观察拍照,同时摄取普通光镜下照片。 1.2方法 12.5 Western blot检测蛋白表达总细胞外信号 1.2.1细胞培养H322、HI299细胞常规培养于调节激酶及其磷酸化蛋白( total and phosphorylation

张东!等! 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制组蛋白去乙酰化酶 !"#$%&’( )*+,*%-.+$*" /012#抑制剂是一类新型的$对多种肿瘤具有抑制功能的制剂"通过抑制多种基因或蛋白介导的信号转导网络的功能"影响细胞的增殖及对化疗药物的敏感性% 3012 抑制剂的诸多功能使其联合其他治疗方法成为新的治疗思路% 我们检测 3012 抑制剂 451 联合紫杉醇对肺癌细胞的协同抑制作用" 期望为临床应用提供理论基础% ! 材料与方法 !"! 材料人肺癌细胞株 3678$398:: 由军事医学科学院惠赠% 四甲基偶氮唑蓝 &;44#$ 二甲基亚砜 &0;5? 公司产品’兔抗人总 @AB 多克隆抗体$鼠抗人磷酸化 @AB&C@AB#多克隆抗体$ 鼠抗人 D1AD 单克隆抗体$ 鼠抗人 !E?,%#’ 单克隆抗体 $ 鼠抗人 5FGH#H#’ 单克隆抗体为美国 2*.. 5#=’?.#’= 公司产品’I21 蛋白测定试剂盒为美国 D#*G,* 公司产品’ 紫杉醇为美国 5#=>? 公司产品’ 451 为美国 2?.I#&,"*> 公司产品% !"# 方法 JK7KJ 细胞培养 3677$3J7:: 细胞常规培养于高糖 0;@; 完全培养液中 &含 JLM胎牛血清"9LL F N >O 青霉素"9LL F N >O 链霉素#"经 LP8QM胰蛋白酶溶液消化传代"在 RST$饱和湿度$含 QU V&. ‘ O"紫杉醇浓度梯度为 _K__J$_K_J$_KJ$J$J_$J__$J___ ’>&. ‘ O’变换用药时 "以吸管吸出原培养液 "DI5 缓冲液 7__ "O 洗涤一次" 再加入相应浓度的药物%451 浓度梯度为 J]Kab$6aKb$ab$Jb_$6__$Z__$ J 7__ ’>&. ‘ O’J7 " 时换为空白培养液% 每组设 6 个复孔"同时设正常和空白对照组% 置 :Z 孔板于培养箱中共培养 :Z "% 按常规方法依次加入 ;44 溶液$裂解液"振荡后测吸光度值&! 值# % 并按下式计算细胞存活率(存活率c!处理组 ! 值 ‘ 阴性对照组 ! 值)WJ__U%采用曲线回归模型拟合其量效关系" 得到各时段 451 作用的半数抑制浓度 !d2b_)% 实验重复 6 次% JK7K6 流式细胞仪分析细胞周期及检测凋亡率取对数生长期的细胞" 以 JWJ_X ‘ 孔接种于 Z 孔板中"当细胞生长至 Z_U密度时"分为正常对照组$ 紫杉醇 7X " 组!41\)$451 J7 " 组!451)$451 作用 J7 " 再加紫杉醇 7X " 组!4^)X 组% J7 " 时换培养液% 451 用药浓度为 6__ ’>&. ‘ O"紫杉醇用药浓度为 J_ ’>&. ‘ O% 按分组时间到期时分别用 _K7bU 胰蛋白酶溶液消化收集细胞"J ___ G ‘ >#’ 离心 J_ >#’"DI5 洗 7 次"重悬细胞于 _KZ >O 的 DI5 液!含 JU胎牛血清) "加入 JKX >O 冷乙醇"混匀固定 " e7LT保存% 检测当天离心"DI5 液洗 7 次"重悬细胞于 LPb >O 的 DI5" 加入 b "O Af?$*"6aT水浴 6_ >#’"再加 J >= ‘ >O 碘化丙啶!Dd)b_ "O"避光" 室温 7_ >#’"上机检测% 实验重复 6 次% JK7KX 荧光显微镜观察细胞核形态变化取对数生长期细胞接种于 Z 孔培养板" 每孔加入 JWJ_b 个细胞"培养液 7 >O"按 JK7K6 的分组"分组时间到期后" 按 JgJ LLL 的终浓度加入 3&*,"$%666X7"于 6ST$饱和湿度$含 bU 2#’"荧光显微镜下紫外光激发 3&*,"$%666X7 呈蓝色"7L 倍显微镜下观察拍照"同时摄取普通光镜下照片% JP7Pb h*$%*G’ i.&% 检测蛋白表达总细胞外信号调节激酶及其磷酸化蛋白!%&%?. ?’) C"&$C"&G-.?%#&’ 杉醇的联合用药组!4^)% 分别以 ;44 法$流式细胞术检测细胞增殖情况以及细胞周期$ 细胞凋亡等指标的变化"荧光显微镜观察细胞核形态的改变 "h*$%*G’ i.&% 检测 5FGH#H#’$D1AD 蛋白及细胞外信号调节激酶 !@AB) 的表达% 结果!451 明显增强了紫杉醇对两种肺癌细胞的抑制率%紫杉醇作用 :Z " 对 3677 细胞的 d2bL 由!XjPLak7ZKJ7) ’>&. ‘ O 下降至 !ZK6X kbKS7)’>&. ‘ O" 对 3J7:: 细胞的 d2b_ 由 !JJ_KZ k6jKS)’>&. ‘ O 下降至 !Z6KS kJJKj)’>&. ‘ O" 差异具有统计学意义!"l_K_b)% 4^ 组 3677 细胞凋亡率较 41\ 组明显增加 !"l_K_b)’ 各组 3J7:: 细胞出现少量凋亡细胞 "4^ 组的死亡细胞明显多于其他组% 41\ 上调 3677 细胞中 C@AB 的表达 "451 及 4^ 减低两种细胞中 C@AB 表达 ’41\ 明显增加 5FGH#H#’ 的表达 "451 及 4^ 下调了 5FGH#H#’ 的表达% 41\ 组和 4^ 组 3677 细胞中均检测到剪切 D1AD 蛋白 "4^ 组较 41\ 组剪切 D1AD 蛋白明显增加" 而 3J7:: 细胞各组均未检测到剪切 D1AD 蛋白 % 结论 ! 3012 抑制剂 451 联合紫杉醇可以协同抑制 3677 及 3J7:: 细胞增殖"促进 3677 细胞凋亡和 3J7:: 细胞死亡% 协同机制可能与通过下调肺癌细胞由紫杉醇诱发的 5FGH#H#’ 高表达和阻断 @AB 通路的激活有关% 关键词 !肺癌’ 组蛋白去乙酰化酶’ 曲古抑菌素 1’ 紫杉醇’ 细胞凋亡’ 细胞外信号通路激酶中图分类号!AS6E6 文献标识码!1 文章编号!J___mXnS\!7__:)J7mJ7S_m_S !"#! C M Y K

1272 张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 extracellular signal regulated kinase. tERK and pERK)、人多聚ADP核糖聚合酶( human Poly ADP HH TAX -ATE ribose polymerase,PARP)以及 Survivin蛋白的表达。按1.2.3的分组,分组时间到期后,用三去污试剂提取总蛋白,用 Bradford方法测定蛋白质浓度。等量蛋白质分别采用SDsS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,然后转至PVDF膜上,5%牛奶室温下摇动封闭后加入一抗,4℃过夜,室温下洗膜20 后加入二抗,用 ECL PLUS( Amersham)进行发光 Time( days) 1.3统计学方法图1TA作用12h、TAX作用96h及联合作用(TSA12 应用SPSs11.0统计软件处理数据,采用单因 h,TAX84h)后H322细胞增殖情况素方差分析(One- Way anova)作各组间差异的显 Proliferation curves of H322 cells treated with 著性检验,并对部分指标进行相关性分析,以a TSA at 12 h, TAX at 96 h, and combined action(TSA 12 h then TAX 84 h) 005为检验水准。应用中位效应分析法( median TSA,mdmA:rAx,pad;TF, TSA followed by TAX. effect analysis)的联合指数( combination index,CI) 法来判断:Cl1提示拮抗,Cl=1 表示附加作用。如果曲线上多于两点以上CI<1表 100礼协同,提示两种药物的作用是协同。 -- TAX 2结果 21HDAC抑制剂TSA对体外培养细胞的增殖抑制作用 TSA与紫杉醇联合应用后,从抑制曲线上看 ISA明显提高了紫杉醇对H322和H1299细胞的抑制水平,紫杉醇对H322细胞的IC由(48.07± Time(days) 26.12)mmol/L下降至(634±572)mmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。紫杉醇对H299细胞的C图2TA作用12h、TAX作用96h及联合作用(TA12 由(110.6±38.7)mmol/L下降至(63.7±1l.8 h,TAX84h)后H1299细胞增殖情况 Figure 2 Proliferation of H1299 cells treated with nmo/L,差异有统计学意义(P<0.05)。根据C方sAat12h, Tax at and combined action(TSA 12 法分析,两种细胞TF组抑制曲线的各点CI值均< h then tax84h) 1,提示TSA联合应用紫杉醇达到了协同效应。两 Abbreviations as in Figure 组细胞的生长曲线见图1,2 22TSA对H322、H1299细胞周期及凋亡的影响表1各组H322细胞周期及凋亡的影响 TSA作用H322及H299细胞12h后,与对 Table 1 Cell cycle and apoptosis changes of H322cls 照组相比细胞周期无明显变化。紫杉醇作用24h in each group( %o x*ts) 后,GM期H322细胞较对照细胞显著增加(P Cell proportion 0.05),同时伴有细胞凋亡;TF组较对照组及TSA Group Go/Gi phase S phase Gy/M phase 组G/G1期细胞减少,而与TAX组相比则是明显conm558044331252.0612.952.170.91076 G。/G1期细胞阻滞,细胞凋亡数较TAX组明显增 ISA 53.47±4.8131.64±2.8514.89±2.231.47±0.54 加(P<0.05),见表1和图3。TAX及TF组中Gm/G1 TAX11.75±1.1229.84±2.3658.41±5.3712.33±1.78 42.70±3.9638.49±3.3518.81±2.1430.00±4.56 期H1299细胞较对照细胞明显增加(P<0.05),G2 M期及S期细胞较对照细胞明显减少(P<005),4psm2 cells Is significantly higher in combine 组细胞凋亡率均较低,见表2及图4。 TSA, trichostatin A, TAX, paclitaxel TF, TSA followed by TAX

!"#$%&!’’(’%$ )*+,%’ $-.(’%/-0 12,%)-! /345 %,0 6785"#人多聚 9:; 核糖聚合酶$?@ 9:A $*B>)- 6>?@=-$%)-!A98A"以及 C($D*D*, 蛋白的表达% 按 EFGFH 的分组!分组时间到期后!用三去污试剂提取总蛋白! 用 I$%0J>$0 方法测定蛋白质浓度& 等量蛋白质分别采用 C:CK聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离!然后转至 AL:M 膜上!NO牛奶室温下摇动封闭后加入一抗!PQ过夜! 室温下洗膜后加入二抗!用 7RS ;STC ’9=-$)=B*,%/*>, *,0-"! R[" 法来判断(E) * R[\E 表示协同!R[]E 提示拮抗!R^ZE 表示附加作用& 如果曲线上多于两点以上 R^\E 表示协同!提示两种药物的作用是协同& $ 结果 $"! %&’( 抑制剂 )*’ 对体外培养细胞的增殖抑制作用 _C9 与紫杉醇联合应用后!从抑制曲线上看! _C9 明显提高了紫杉醇对 ‘HGG 和 aEGbb 细胞的抑制水平!紫杉醇对 aHGG 细胞的 ^RNU 由’PcFUde GfFEG" ,=>’ g S 下降至’fFHPeNFdG" hij? g k!差异有统计学意义’!\UFUN"& 紫杉醇对 ‘EGbb 细胞的 [RNU 由 ’EEUFf eHcFd" hij? g k 下降至 ’fHFd eEEFc" hij? g k!差异有统计学意义’!\UFUN"& 根据 R[ 方法分析!两种细胞 _M 组抑制曲线的各点 R[ 值均\ E!提示 _C9 联合应用紫杉醇达到了协同效应& 两组细胞的生长曲线见图 E!G& $"$ )*’ 对 %#$$!%!$++ 细胞周期及凋亡的影响 _C9 作用 ‘HGG 及 ‘EGbb 细胞 EG ?*J-$%/*>h &($D- >J ‘EGbb &-??) /$-%/-0 p*/< _C9 %/ EG <! _9n %/ bf <! %h0 &jiB*h-0 %&/*jh ’_C9 EG < /<-h _9n cP <" 9BB$-D*%/*jh) %) *h M*+($- EF Rjh/$j? _C9 _9n _M lU g lE 6<%)- NNFcUePFPH NHFPdePFcE EEFdNeEFEG PGFdUeHFbf C 6<%)- HEFGNeGFUf HEFfPeGFcN GbFcPeGFHf HcFPbeHFHN lG g o 6<%)- EGFbNeGFEd EPFcbeGFGH NcFPEeNFHd EcFcEeGFEP UFbEeUFdf EFPdeUFNP EGFHHeEFdc HUFUUePFNf% R-?? 6$j6j$/*jh 96j6/j)*) $%/- l$j(6 表 ! 各组 "#$$ 细胞周期及凋亡的影响 %&’() ! *)(( +,+() &-. &/0/10232 +4&-5)2 06 "7$$ +)((2 3- )&+4 5809/ ": !;2$ 张东!等F 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 % 96j6/j)*) $%/- jJ ‘HGG &-??) *) )*+h*J*&%h/?@ <*+<-$ *h &jiB*h-0 +$j(6 ’_M" /<%h *h j/<-$ +$j(6) ’!\UFUN"F _C9! /$*&<j)/%/*h 9! _9n! 6%&?*/%"-?+ _M! _C9 Jj??jp-0 B@ _9nF 图 E _C9 作用 EG <!_9n 作用 bf < 及联合作用"_C9 EG <# _9n cP <$后 ‘HGG 细胞增殖情况 M*+($- E ;$j?*J-$%/*jh &($D-) jJ ‘HGG &-??) /$-%/-0 p*/< _C9 %/ EG <! _9n %/ bf <! %h0 &jiB*h-0 %&/*jh’_C9 EG < /<-h _9n cP <" _C9! /$*&<j)/%/*h 9+ _9n! 6%&?*/%"-?+ _M! _C9 Jj??jp-0 B@ _9nF !"#" C M Y K

张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 1273 Control TAX 24 h TSA 12 h 80 DNA Content DNA Content DNA Content DNA Conter 图3流式细胞仪检测各组H322细胞的凋亡情况 gure 3 Flow cytometric analysis of each group of H322 cells 表2各组H1299细胞周期及凋亡的影响对照组H322和H1299细胞核为圆形、椭圆 Tabe2 Cell cycle and apoptosis changes of H299cel形,少量呈半月形;TSA组、紫杉醇组及联合应用 in each group(%,x±s) 组H1299细胞核多呈偏心性改变,细胞核呈马蹄 Cell proportion 铁样改变,伴有多核、空泡变性等死亡象,只有很 Group Go/GI phase s phase Gy/M phase 少的凋亡小体。TF组较其他组有更多的细胞死 Control53.25±4.5630.46±3.1416.29±2.12 亡。在 Hoechst33342染色下,TAX及TF组可见较 SA58.51±5.5428.23±3.0713.26±1.810.02±0.05 TAX6992±5.6318.80±2.3211.29±2.090.33±0.28 多H322细胞破碎及凋亡小体,TSA组有少量凋亡 78.82±6.3812.26±1.848.91±1.171.47±0.89 小体。见图5。 a p<0.05, comparing with control group with significant increase; P 23TSA对ERK及 Survivin蛋白表达的影响 0.05, comparing with control group with significant decreas 将正常组和TAX组的pERK表达水平分别 Abbreviations as in Table 1 与相应组的tRK进行比较,H322正常组 TAX 24 h TSA 12 h 400 180 160 80 000 DNA Content DNA Content DNA Conte DNA Content 图4流式细胞仪检测各组H1299细胞凋亡情况 Figure 4 Flow cytometric analysis of each group of H1299 cells pERK/ERK为1.26,TAX组pERK/ERK为1.42, Survivin蛋白的表达均增加,分别是正常对照组的提示TAX应用后H322pERK蛋白表达略有增1.71倍、1.61倍;TSA下调 Survivin蛋白的表达,分加;H1299正常组pERK/ERK为0.45,TAX组别是对照组的78%、46%。TSA联合TAX应用明显 pERK/ERK为0.23,pERK蛋白表达下降。TSA下调了由TAX引起的 Survivin蛋白的高表达的单独应用下调了H322、H1299细胞中 PERK Survivin蛋白表达水平分别是TAX组的51% 蛋白的表达水平。TF组明显抑制pERK蛋白的33%。见图6。表达,H322及H1299细胞均较TAX组下降。见 TAX和TF组均检测到PARP蛋白表达,TF组图6 较TAX组PARP蛋白明显增强;而H1299各组均 TAX作用24h后H322及H1299细胞中未检测到剪切PARP蛋白。见图6

1274 张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制 6 图5各组细胞核形态的变化( Hoechst33342×20) Figure 5 Nuclear morphology of each group of cells stained with Hoechst 33342(X20) A, H1299 cells control (H1299 cells nuclei are round and oval, and a small number of them half-moon B, H1299 cells treated with TSA for 12 h ( H1299 cell nuclei show horseshoe-like changes accompanied by multi-core and death of the phenomenon, such as vacuolar degeneration C, H1299 cells treated with TAX for 24 h (H1299 cell nuclei show horseshoe-like changes accompanied by multi-core and death of the phenomenon, such as vacuolar degeneration, a small number of apoptotic bodies ): D, H1299 cells treated with TF(H1299 cell nuclei show horseshoe-like changes: accompanied by multi-core and death of the phenomenon uch as vacuolar degeneration, a small number of apoptotic bodies); E, H322 cells control (H322 cells show round nuclei, including a small number of oval-shaped nuclei): F, H322 cells treated with TSA for 12 h(a small amount of H322 cell nuclei fragmentation and a small number of apoptotic bodies are shown G, H322 cells treated with TAX for 24 h (more H322 cell nuclei fragmentation, dissolution, and more apoptotic bodies are shown ) H, H322 cells treated with TF (more H322 cell nuclei fragmentation, dissolution, and more apoptotie bodies are shown) 3讨论这一结果提示联合用药会因细胞特性的不同而产生不同效果。化疗是治疗肿瘤的主要方法,但由于耐药率 HDAC抑制剂通过引起细胞周期阻滞和诱的上升,化疗的有效率一直不尽如人意。近年的研导细胞凋亡达到抑制肿瘤生长的目的。不同究发现,HDAC抑制剂可以通过抑制信号转导网HDAC抑制剂作用于不同细胞,会出现不同的细络,影响细胞增殖及细胞对化疗药物的敏感性口。胞周期改变。 Blagosklonny等的研究显示,TSA HDAC抑制剂联合化疗可能会减少化疗的耐药率,和丁酸导致A549细胞阻滞于G1期,而DP则导致提高化疗的有效率。 Fino等口应用HDAC抑制剂A549细胞周期阻滞于G2/M期。本研究结果显示, LAQ824与多种化疗药物同时作用于乳腺癌细胞,TSA导致H1299和H322细胞周期阻滞于G1期, 发现LAQ824可以增强紫杉醇、吉西他滨等化疗药较单独用药更为复杂的是,联合用药后的细胞周物诱导的细胞凋亡,提高乳腺癌细胞对化疗药物期改变。TSA与紫杉醇联合应用后,在H1299细胞的敏感性。 Imanishi等的研究显示,HDAC抑制剂维持或增加了G1期阻滞,而在H322细胞则出现都可以增加紫杉醇致肿瘤细胞死亡作用。本研究G2及S期的阻滞;紫杉醇主要在G2期发挥功能结果显示,HDAC抑制剂TSA与紫杉醇联合应用,G1期阻滞相对减少了紫杉醇作用的靶细胞数,因能提高紫杉醇对肺腺癌细胞HI29及H322的抑此G1期的细胞阻滞可能会影响紫杉醇的药物敏感制率,使紫杉醇对两种细胞的ICs明显下降,提高性。在本研究中,我们所检测的细胞周期变化是对这两种细胞的抑制敏感性。但联合用药后紫杉36h内的早期变化,结合细胞生长抑制曲线的结醇对两种细胞的ICo下降程度却不同,对H322细果,早期G1期的阻滞并不会降低紫杉醇的细胞生胞的ICs下降约7倍,而对H1299细胞下降2倍,长抑制能力,因为HDAC抑制剂诱导G1期的阻

1276 张东,等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制示TSA与紫杉醇联合应用较单独应用紫杉醇增加H322的生长抑制功能,联合应用的协同作用在了H322细胞的凋亡。 Hoechst33342染色的结果进H322细胞表现为细胞凋亡的增加,而在H1299细一步证实TSA增强了紫杉醇诱导的细胞凋亡。与胞则可能存在非凋亡因素。联合应用后,TSA抑制 H322细胞不同的是,H1299细胞凋亡的发生较少,了 survivin及pERK的表达,这可能是协同紫杉醇在联合用药组,流式细胞仪只检测到147%的细胞毒性作用的机制凋亡,虽然都较单独应用紫杉醇诱导的细胞凋亡率高,但这样低的凋亡水平不足以解释抑制曲线 [参考文献] 的变化。另外PARP蛋白的检测未见剪切PARP的[1 Edelman M, Quam H, Mullins b. Interactions of 出现, Hoechst3342染色显示细胞核形态改变及发 gemcitabine, carboplatin and paclitaxel in molecularly defined 现非常少的凋亡小体,这些结果均提示TSA与紫 on-small lung cancer cell lines [J]. Cancer Chemother Pharmacol,2001,48(2):141-144 杉醇联合应用于H1299细胞的协同作用不是诱(21Yx.,cms,MamM,a. Modulation of p53 导的细胞凋亡的增加,可能存在细胞非凋亡性死 ErbB1. ErbB2, and Raf-I expressionin lung cancer cells by 亡。 Chobanian等[8的研究也提示,HDAC抑制剂 depsipeptide FR901228 [J]. J Natl Cancer Inst, 2002, 94 TSA、SAHA联合紫杉醇作用于卵巢癌细胞所致的 (7):504-51 细胞凋亡,只是最终细胞死亡的部分原因。因此我 [3] Fuino L, Bali P, Wittmann S. Histone deacetylase inhibitor 们认为在紫杉醇及与TSA联合应用的早期,对 LAQ824 down-regulates Her-2 and sensitizes human breast ancer cells to trastuzumab, taxotere, gemcitabir H1299细胞的抑制作用中细胞凋亡不是主要机 epothilone B [J]. Mol Cancer Ther, 2003, 2(10): 971-984 制,可能存在非凋亡性死亡因素。两种细胞株不同[4] Imanishi R, Ohtsur A, Iwamatsu M,cta. A histone 的死亡机制是否与联合用药后紫杉醇对两种细胞 deacetylase inhibitor enhances killing of undifferentiated 的ICs值下降程度不同有关,有待进一步研究。抗肿瘤药物激活肿瘤细胞一系列的致死相关 Endocrinol metab,2002,87(10):4821-4824 [5] Blagosklonny MV, Robert R, Sackett DL, et al. Histone 基因,引发肿瘤细胞的坏死和凋亡,但同时诱导肿 deacetylase inhibitors all induce p21 but differentially cause 瘤细胞的自身保护反应,释放抗凋亡基因,激活细 tubulin acetyl mitotic arrest, and cytotoxicity [J]. Mol 胞信号通路,使肿瘤细胞得到继续增殖,避免死 Caneer Ther,2002,1(11):937-941 亡。在这些保护反应中, survivin基因表达增加及61kmYB.kisw.)ohM,eal.Mh ERK通路的激活都有很重要的作用,而且这种保 arrest caused by histone deacetylase in in human carcinoma cells [J]. J Antibiot (Tokyo), 2000, 53: 1191 护反应与肺癌患者的分期、预后及药物敏感性有着密切的关系,阻断这种保护反应将有助于[7] Kaufmann SH, Desnoyers S. Ottaviano Y,tl. Specifie 提高化疗的有效性90。本研究结果也显示,0.01 proteolytic cleavage of poly (ADP-ribose polymerase: umol/L的紫杉醇作用24h后,H322和H1299细 early marker of chemotherapy-induced apoptosis [J].Cancer 胞的 Survivin表达是正常组的1.71倍和1.61倍 Res,1993,53:3976-3985 pERK在H322细胞有轻度的增高,而在H1299细 [8] Chobanian NH, Greenberg VL, Gass JM, et al. Histone deacetylase inhibitors enhance paclitaxel-indueed cell death in 胞则有下降,pERK的变化与紫杉醇的浓度及作用 ovariancancer cell lines independent of p53 status [J] 时间有关,研究显示低浓度长时间或高浓度紫杉 Anticancer Res, 2004, 24(2B): 539-545 醇才激活ERK通路,即增加pERK的表达m本研9]LuB, Gonzalez a, Massion Pl,cta. Nuclear survivin as a 究应用0.01μmol/L的紫杉醇作用24h,因此可能 biomarker for non-small-cell lung cancer [J]. Br JCancer 尚未达到激活ERK通路的浓度或时间。TSA单独 [10] Suyama H, Igishi T, Sano H, et al. ERK activation and 应用及联合紫杉醇后,在两种细胞中均明显抑制 subsequent RB phosphorylation are important determinants of 了 Survivin及pERK的表达,重要的是联合应用后 the sensitivity to paclitaxel in lung adenocarcinoma cells [J] Survivin及pERK的表达均较紫杉醇单独应用后明 Int J Oncol,2004,24(6):1499-1504. 显下降,提示TSA抑制了两种细胞的自身保护反[11 Okano j, Rustgi AK. Paclitaxel induces prolonged activation 应,这可能是协同紫杉醇毒性作用的机制。 of the Ras/MEK/ERK pathway independentlyof activating the ogrammed cell death machinery [J]. J Biol Chem, 2001 总之,HDAC抑制剂TSA与化疗药物紫杉醇 276(22):19555-19564. 联合应用,可以提高紫杉醇对肺癌细胞H1299和 [编辑及校对:张菊]

!!" !"" !#" !$" !%" !&" !’" !(" !)" !!*" !!!" 张东!等+ 组蛋白去乙酰化酶抑制剂协同紫杉醇对人肺癌细胞株抑制作用及机制示 ,-. 与紫杉醇联合应用较单独应用紫杉醇增加了 /#"" 细胞的凋亡# /012345###$" 染色的结果进一步证实 ,-. 增强了紫杉醇诱导的细胞凋亡# 与 /#"" 细胞不同的是$/!")) 细胞凋亡的发生较少$ 在联合用药组$流式细胞仪只检测到 !+$’6的细胞凋亡$ 虽然都较单独应用紫杉醇诱导的细胞凋亡率高$ 但这样低的凋亡水平不足以解释抑制曲线的变化% 另外 7.87 蛋白的检测未见剪切 7.87 的出现&/012345###$" 染色显示细胞核形态改变及发现非常少的凋亡小体& 这些结果均提示 ,-. 与紫杉醇联合应用于 /!")) 细胞的协同作用不是诱导的细胞凋亡的增加&可能存在细胞非凋亡性死亡% 930:;.9 抑制剂 ,-.’-./. 联合紫杉醇作用于卵巢癌细胞所致的细胞凋亡&只是最终细胞死亡的部分原因#因此我们认为在紫杉醇及与 ,-. 联合应用的早期 &对 /!")) 细胞的抑制作用中细胞凋亡不是主要机制&可能存在非凋亡性死亡因素#两种细胞株不同的死亡机制是否与联合用药后紫杉醇对两种细胞的 ?9%* 值下降程度不同有关&有待进一步研究# 抗肿瘤药物激活肿瘤细胞一系列的致死相关基因&引发肿瘤细胞的坏死和凋亡&但同时诱导肿瘤细胞的自身保护反应&释放抗凋亡基因&激活细胞信号通路& 使肿瘤细胞得到继续增殖& 避免死亡# 在这些保护反应中& 4@AB=B=.9 抑制剂 ,-. 与化疗药物紫杉醇联合应用& 可以提高紫杉醇对肺癌细胞 /!")) 和 /#"" 的生长抑制功能& 联合应用的协同作用在 /#"" 细胞表现为细胞凋亡的增加&而在 /!")) 细胞则可能存在非凋亡因素# 联合应用后&,-. 抑制了 4@AB=B=H& 15 ;F+ /=450147SA=:041) I0FRE1A;41* ;< 1;AFR E;A_1A 0O 231E0531A;IRS=<J@21J ;I0I504=4 !L"+ 9;<21A 814& !))#&%#*#)’&T#)(%+ 930:;<=;< Z/& WA11<:1AP ‘H& W;44 LK& 15 ;F+ /=450<1 J1;215RF;41 =<3=:=50A4 1<3;<21 I;2F=5;Q1FS=<J@21J 21FF J1;53 =< 0B;A=;<2;<21A 21FF F=<14 =<J1I1<J1<5 0O I%# 45;5@4 !L"+ .<5=2;<21A 814& "**$&"$("N)*%#)T%$%+ H@ N& W0<];F1] .& K;44=0< 77& 15 ;F+ Z@2F1;A 4@AB=B=< ;4 ; :=0E;A_1A O0A <0<S4E;FFS21FF F@<P 2;<21A !L"+ NA L 9;<21A+ "**$&)!(#)*%#’T%$*+ -@R;E; /& ?P=43= ,& -;<0 /& 15 ;F+ C8D ;25=B;5=0< ;<J 4@:41a@1<5 8N I304I30ARF;5=0< ;A1 =EI0A5;<5 J151AE=<;<54 0O 531 41<4=5=B=5R 50 I;2F=5;Q1F =< F@<P ;J1<02;A2=<0E; 21FF4 !L"+ ?<5 L ^<20F& "**$&"$(&)*!$))T!%*$+ ^_;<0 L& 8@45P= .D+ 7;2F=5;Q1F =<J@214 IA0F0<P1J ;25=B;5=0< 0O 531 8;4 G KCD G C8D I;53\;R =<J1I1<J1<5FR0O ;25=B;5=<P 531 IA0PA;EE1J 21FF J1;53 E;23=<1AR !L"+ L N=0F 931E& "**!& "’&("")*!)%%%T!)%&$+ !编辑及校对#张菊" !"#$ C M Y K