基因工程原理实验指导 实验一质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术】 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂 解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克降有水稻外源片段 的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的 RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质 粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养 2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃ 摇床，250rmin过夜培养： 3.吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液：吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净： 4.加入300μ1溶液1振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块)： 5.加入300μ1溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟： 6.加入300μ1溶液Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀： 12000g离心10分钟： 7.吸取8O0μ1上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管 中，加入23体积的异丙醇，室温下放置5分钟： 12000g常温离心15分钟： 8.倒尽上清，加75%乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）： 9.室温放置或超净台上风干DNA: 10.加40μ1灭菌超纯水或TE溶解： 11.质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存. 基因工程原理实验指导 6 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂 解、质粒 DNA 的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的： 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料： 含有质粒 pUC18 载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段 的 BAC 的大肠杆菌菌液。 实验原理： 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质 粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。 实验步骤： 1． 取含有 pUC18 质粒的大肠杆菌菌液于 LA 培养基上 37 ℃过夜培养； 2． 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37 ℃ 摇床，250 r/min 过夜培养； 3． 吸取 1.5 ml 菌液， 12000 g 离心 2 分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取 1.5 ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4． 加入 300 μl 溶液 I 振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块）； 5． 加入 300 μl 溶液 II ，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过 5 分钟； 6． 加入 300 μl 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g 离心 10 分钟； 7． 吸取 800 μl 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一 Eppendorf 管 中，加入 2/3 体积的异丙醇，室温下放置 5 分钟； 12000 g 常温离心 15 分钟； 8． 倒尽上清，加 75 ％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心 3 分钟后倒去上清）； 9． 室温放置或超净台上风干 DNA ； 10． 加 40 μl 灭菌超纯水或 TE 溶解； 11． 质粒、 BAC 的质量检测，于 -20 ℃保存