基因工程原理实验指导 附注：质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm的比值介于1.7一1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳， 低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它己成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，己成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。 实验原理：在H值为80一83时，核酸分子威基几平不解离，磷移全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子蹄的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较》 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB)后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验步骤： 1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上： 2,调整好梳子的高度： 3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至4550℃时倒入制胶板中： 4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带： 5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中： 6.pUC185μ1+ddH203μ1+溴酚蓝2μl共10u】于0.5 ml tube中混合后 点样： 7.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动： 8.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μgml的溴化乙锭(EB)溶液 中染色10一I5mi,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记 录。 附注：1.影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： ①DNA分子大小迁移速率U与IogN成反比(N为碱基对数目)。分子大 小相等，电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大，迁移越慢。等量的 空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA)基因工程原理实验指导 7 附注： 质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm 的比值介于 1.7 － 1.9 之间，说明质粒质量较好， 1.8 为最佳， 低于 1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8 说明有 RNA 污染。 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的： 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料： 质粒 DNA 、 BAC 、植物总 DNA 或它们的酶切产物。 实验原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳 支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大 的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验步骤： 1． 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上； 2． 调整好梳子的高度； 3． 称取 0.24 g 琼脂糖于 30 ml 0.5 × TBE 中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至 45-50℃ 时倒入制胶板中； 4． 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带； 5． 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中； 6． pUC18 5μl + ddH2O 3μl + 溴酚蓝 2μl 共 10μl 于 0.5ml tube 中混合后 点样 ； 7． 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动； 8． 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入 0.5 μg/ml 的溴化乙锭（ EB）溶液 中染色 10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记 录。 附注： 1．影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： ① DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（ N 为碱基对数目）。分子大 小相等，电荷基本相等（ DNA 结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的 空间结构紧密的电泳快（超螺旋 > 线性 DNA ）