基因工程原理实验指导 ②琼脂糖浓度：logU=logU0Krt胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电 泳迁移率，t为胶浓度，K灯为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范 围的DNA Agarose 0.5%：1-30kb 0.7%:0.8-12kb 1.2%:0.4-7kb:1.5%:02-3kb. ③DNA构象： 一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变 化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 ④所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分 排效果 凝胶 上所加电压不应超过 t 5V/em ⑤碱基组成与温度： 般影响不大4-30℃ ©嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率（不提倡加在电泳液中） ⑦电泳缓冲液(O.5XTBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无 离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA 变性， 般采用1XTAE,1XTBE,1XTPE(均含EDTA PH8.0 2.溴化乙锭(EB)为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3.电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝(bromophenol blue,Bb) 呈蓝紫色：二甲苯晴(xylene cyanol,Xc)呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝 少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯 化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆 所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。 实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段， 克隆载体为PUC18。 实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的 外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应：选择克隆载体pUC18多克隆 位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连：在连接酶 的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验步骤： 1.载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切： (50l反应体系，用1.5 ml tube,冰上操作) DNA 30 ul R.E1ul 10×buffer5l ddH2O 14 ul 基因工程原理实验指导 8 ② 琼脂糖浓度： logU=logU0Krt 胶浓度， U 为迁移率，U0 为 DNA 的自由电 泳迁移率， t 为胶浓度， Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范 围的 DNA Agarose ： 0.5% ： 1-30 kb ； 0.7% ： 0.8-12 kb 1.2% ： 0.4-7 kb ； 1.5% ： 0.2-3 kb. ③ DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状 > 线状 DNA> 单链开环。当条件变 化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。 ④ 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分 辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm ⑤ 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 ℃ ⑥ 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率 ( 不提倡加在电泳液中 ) ⑦ 电泳缓冲液 （ 0.5 × TBE ）的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无 离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用 1 × TAE ， 1 × TBE ， 1 × TPE （均含 EDTA pH 8.0 ）。 2．溴化乙锭（ EB ）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ） 呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝 少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。 实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆 DNA 重组技术包括载体及外源 DNA 片段的酶切消化、目的片段的获得及纯 化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。 DNA 片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 实验目的： 学习 DNA 的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将 BAC 克隆 所携带的外源 DNA 酶切片段亚克隆到 pUC18 载体上。 实验材料： 外源片段来自一个含有水稻 DNA 片段的 BAC 克隆的酶切片段， 克隆载体为 PUC18 。 实验原理： 限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的 外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体 pUC18 多克隆 位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶 的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 实验步骤： 1．载体 pUC18 和外源 DNA 片段的限制性酶切： （ 50 µl 反应体系，用 1.5ml tube ，冰上操作） DNA 30 µl R.E 1 µl 10 × buffer 5 µl ddH2O 14 µl