基因工程原理实验指导 37℃反应1hr,分别取8山外源片段酶切产物和5lPUC18酶切产物于 1.O%凝胶检测酶切是否完全：按2一5步纯化、回收DNA 2.加入ddH20150l(扩大体积)，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)， 颠倒混匀，12000g离心10min: 3.吸取上清，加110体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分 钟以上： 4.12000g4C冷冻离心15分钟： 5.倒去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10山l ddH2O (0.5 ml tube中)，PUC18溶于20 ulddH0(1.5 ml tube中)； 6.按以下反应去除载体PUC18的5磷酸基团，50℃反应30min以上 DNA 20 ul CIAP(TaKaRa)0.5μl 10xbuffer 4 0 ul ddH2O 15.5 ul 7.70℃水浴10min,使CIAP失活： 8.按2一5步纯化载体，溶于10lddH0 9.连接反应(15体系)： DNA 10 ul pUC18 2.5 ul 5xbuffer 1.5 ul T4 ligase (3U/ul)1 ul 16℃水浴过夜 10.转化大肠杆菌感受态细胞 11.转化子的鉴定 附注： 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切 可实现外源片段的定向克隆 克降中用到的几种工具酶 (1)限制性内切翼 限制性内切酶的一个活性单位(1U)：指在50反应体系中，37℃下，经 过1小时的反应将1gDNA完全切割所需要的酶量。 限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时，对DNA切割的位点 特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列， 这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件 有关。 9基因工程原理实验指导 9 37 ℃反应 1hr ，分别取 8 µl 外源片段酶切产物和 5 µl PUC18 酶切产物于 1.0% 凝胶检测酶切是否完全；按 2 － 5 步纯化、回收 DNA 2．加入 ddH2O 150 µl （扩大体积），加入等体积氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）， 颠倒混匀， 12000g 离心 10 min ； 3．吸取上清，加 1/10 体积 3M NaAc 和两倍体积无水乙醇， -20 ℃放置 15 分 钟以上； 4．12000g 4 ℃冷冻离心 15 分钟； 5．倒去上清，用 75 ％乙醇浸洗沉淀，风干后外源 DNA 溶于 10 µl ddH2O （ 0.5ml tube 中）， PUC18 溶于 20µl ddH2O （ 1.5ml tube 中）； 6．按以下反应去除载体 PUC18 的 5 '磷酸基团， 50 ℃反应 30 min 以上 DNA 20 µl CIAP （ TaKaRa ） 0.5 µl 10×buffer 4.0 µl ddH2O 15.5 µl 7．70 ℃水浴 10 min, 使 CIAP 失活； 8．按 2 － 5 步纯化载体，溶于 10 µl ddH2O ； 9．连接反应（ 15 µl 体系）： DNA 10 µl pUC18 2.5 µl 5×buffer 1.5 µl T4 ligase (3U/ µl) 1 µl 16 ℃水浴过夜 10．转化大肠杆菌感受态细胞 11．转化子的鉴定 附注： 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切 可实现外源片段的定向克隆。 克隆中用到的几种工具酶： （ 1 ）限制性内切酶 限制性内切酶的一个活性单位（ 1U ）：指在 50 µl 反应体系中， 37 ℃下，经 过 1 小时的反应将 1µg DNA 完全切割所需要的酶量。 限制性内切酶的 star 活性：限制酶在某些条件下使用时，对 DNA 切割的位点 特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定 DNA 序列不同的碱基序列， 这种现象叫限制酶的 star 活性。它的出现与限制酶、底物 DNA 以及反应条件 有关