基因工程原理实验指导 （2)碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)都能催化水解DNA RNA、dNTP和NTP上的分一磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其 可在0℃10'内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比 BAP的高10一20倍。它主要用于：(1)克隆时去除载体的5-P,以防 载体自连：(2)在用Kinase进行5'末端标记前，去除DNA的5-P。 (3)连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶 但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其在正常的反应条件 下能有效的将平端连接起来。 氯仿对眼晴、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾 脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重 烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。 实验四感受态细胞的制备 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌 摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同 的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CCh2法将外源 DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaC2感受态细 胞。 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 实验材料：大肠杆菌菌株DH5a或DH10B 实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超 纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电 离子。10~1010转化子/gDNA: 对于热激法，是利用冰冷的CCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂 的“感受态”，易于摄取外源DNA。10~10?转化子gDNA。 ,CaC2感受态细胞的制备的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜（约16小时）： 2.取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 约2.5-3小时(250-300rpm): 3.将0.1 M CaCl2溶液置于冰上预冷： 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 0 基因工程原理实验指导 10 （ 2 ）碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶（ BAP ）和牛小肠碱性磷酸酶（ CIAP ）都能催化水解 DNA 、 RNA 、 dNTP 和 NTP 上的 5' －磷酸残基。比较而言， CIAP 更常用，因其 可在 70 ℃ 10 '内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时 CIAP 的活性比 BAP 的高 10 － 20 倍。它主要用于：（ 1 ）克隆时去除载体的 5'-P ，以防 载体自连；（ 2 ）在用 Kinase 进行 5' 末端标记前，去除 DNA 的 5'-P 。 （ 3 ）连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和 T4 噬菌体连接酶， 但几乎在所有的克隆中 T4 噬菌体连接酶都是首选的酶，因其在正常的反应条件 下能有效的将平端连接起来。 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾 脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重 烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。 实验四 感受态细胞的制备 体外连接的 DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌 摄取外源 DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同 的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和 CaCl2 法将外源 DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和 CaCl2 感受态细 胞。 实验目的： 学习感受态细胞的制备过程 实验材料： 大肠杆菌菌株 DH5α 或 DH10B 实验原理： 对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超 纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电 离子。 109 ～ 1010 转化子 /µg DNA； 对于热激法，是利用冰冷的 CaCl2 处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂 的 “感受态”，易于摄取外源 DNA。106 ～ 107 转化子 /µg DNA。 ·CaCl2 感受态细胞的制备的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α 或 DH10B），挑取单菌落于 LB 培养基中 37℃摇 床培养过夜（约 16 小时）； 2．取 1ml 过夜培养物转接于 100ml LB 培养基中，在 37℃摇床上剧烈振荡培养 约 2.5-3 小时（250-300rpm）； 3．将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml 培养好的菌液至 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10 分钟； 5．4℃下 3000g 冷冻离心 5 分钟；