基因工程原理实验指导 6.弃去上清，加入100ul预冷0.1MCaC2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 8.弃去上清，加入100ul预冷0.1MCaC12溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮： 9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%·20%甘油)后超 低温冷冻贮存备用（一70℃）。 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DHI0B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜： 2.取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至0D000.6(约2.5-3小时)； 3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 6.弃去上清，加入1500u冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟 8.弃去上清，加入750如冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细 胞重新悬浮： 9.4℃下3000g冷冻离心5分钟 10.加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮： 11.立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。 附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： 1.细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数 生长期的细胞（一般通过检测OD6o0来控制。DH5a菌株OD%oo为0.5时细胞密 度是5×10ml): 2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行： 3.经CC2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而 增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长 而减少造成的) 4.化合物及无机离子的影响：在Ca2的基础上联合其他二价金属离子（如M 或Co2+)、DMS0或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高(100-1000 倍)： 5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低基因工程原理实验指导 11 6．弃去上清，加入 100µl 预冷 0.1M CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮，在冰放置 20 分钟； 7．4℃下 3000g 冷冻离心 5 分钟； 8．弃去上清，加入 100µl 预冷 0.1M CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮； 9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（ 15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 ·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α 或 DH10B），挑取单菌落于 LB 培养基中 37℃摇 床培养过夜； 2．取 2ml 过夜培养物转接于 200ml LB 培养基中，在 37℃摇床上剧烈振荡培养 至 OD600=0.6（约 2.5-3 小时）； 3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml 培养好的菌液至 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10 分钟； 5．4℃下 3000g 冷冻离心 5 分钟； 6．弃去上清，加入 1500µl 冰冷的 10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮； 7．4℃下 3000g 冷冻离心 5 分钟 8．弃去上清，加入 750µl 冰冷的 10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细 胞重新悬浮； 9．4℃下 3000g 冷冻离心 5 分钟 10．加入 20µl 冰冷 10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11．立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。 附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： 1． 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数 生长期的细胞（一般通过检测 OD600 来控制。DH5α 菌株 OD600 为 0.5 时细胞密 度是 5 × 107 /ml ）； 2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3．经 CaCl2 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而 增加， 24 小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长 而减少造成的）； 4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+ 或 Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）； 5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低