基因工程原理实验指导 细茵的转化效率： 6.质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA: 7.一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比： 实验五质粒的转化及转化子的鉴定 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物 转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种 方法筛选和鉴定目的克隆。 实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方 法。 实验材料：外源片段与载体的连接产物，大肠杆菌感受态细胞。 实验原理： (I)热激法：大肠杆菌在0℃CCh低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化 混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数 小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达， 在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 (2)电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不 仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在 电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 热激法转化实验步骤： 1.制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中加入250 ul Amp (100mg/ml）,250ulX-gal(20mgml),25 plIPTG(200mgml),混匀后倒 入灭菌培养皿中： 2.取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化： 3.每100ul感受态细胞加入约20g质粒DNA，3管分别加连接产物、标 准超螺旋质粒DNA(阳性对照)及不加入任何DNA(阴性对照)，用移液 器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟： 4.热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管： 5.冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1一2分钟 6.复苏：每管加400ulS0C培养基，在37℃摇床温和摇动温有45分钟， 使细菌复苏： 7.涂皿：取适当体积均匀涂布于含有PTG、X-gal、抗生素(Amp)的LA 平板： 8.培养：倒置培养皿，于37℃培养12一16小时即可观察到蓝白相间的 12 基因工程原理实验指导 12 细菌的转化效率； 6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ； 7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比； 实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物 转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种 方法筛选和鉴定目的克隆。 实验目的： 掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方 法。 实验材料： 外源片段与载体的连接产物，大肠杆菌感受态细胞。 实验原理： （1）热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化 混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数 小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达， 在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不 仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在 电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 热激法转化实验步骤： 1．制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中加入 250µl Amp （ 100mg/ml ）， 250µl X-gal (20mg/ml) ， 25µl IPTG (200mg/ml) ，混匀后倒 入灭菌培养皿中； 2．取出 3 管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3．每 100µl 感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA ， 3 管分别加连接产物、标 准超螺旋质粒 DNA （阳性对照）及不加入任何 DNA （阴性对照），用移液 器轻轻吸打均匀，在冰上放置 30 分钟； 4．热击：将离心管放置 42 ℃水浴，热击 90 秒，注意：勿摇动离心管； 5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置 1 － 2 分钟； 6．复苏：每管加 400µl SOC 培养基，在 37 ℃ 摇床温和摇动温育 45 分钟， 使细菌复苏； 7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有 IPTG 、 X-gal 、抗生素（ Amp ）的 LA 平板； 8．培养：倒置培养皿，于 37 ℃ 培养 12 － 16 小时 即可观察到蓝白相间的