基因工程原理实验指导 菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化 子) 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 1.制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中加入250 ul Amp (100mg/ml),250ulX-gal(20mg/ml),25 ulIPTG(200mgml),混匀后倒 入灭菌培养皿中： 2.取出削备好的感受态细胞，放在冰上融化： 3.每管感受态细胞加入1连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上： 4.电转化仪选择1800V作为输出电压： 5.将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，立即按下按纽电击： 6.立即加1mlS0C培养基到转化杯中重悬细胞： 7.将细胞转入合适的培养管中37℃培养1小时： 8.吸取合适体积的菌液涂布己倒好的选择培养基平板： 9.37℃培养过夜，观察结果。 附注：1.利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低 (90mm平板上不得超过103个菌落)，同时37℃培养不应超过20小时， 具氨苄青霉素抗性的转化体可将阝一内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周 围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 2.鉴定转化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有： ①a互补： ②杂交筛选： ③插入失活（一些老质粒如pBR322等）： ④小量提取质粒，并酶切或PCR检测 实验六PCR技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统 是分子克隆技术中的常用技术之一。PC具有反应快速、灵敏、操作简便等优 点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。 实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程 实验材料：转基因水稻叶片总DNA,外源基因的特异引物 实验原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶 的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变 性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段 得到大量扩增。 实验步骤：基因工程原理实验指导 13 菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化 子） 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 1．制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中加入 250µl Amp （ 100mg/ml ）， 250µl X-gal (20mg/ml) ， 25µl IPTG (200mg/ml) ，混匀后倒 入灭菌培养皿中； 2．取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3．每管感受态细胞加入 1µl 连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； 4．电转化仪选择 1800V 作为输出电压； 5．将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化杯中，立即按下按纽电击； 6．立即加 1ml SOC 培养基到转化杯中重悬细胞； 7．将细胞转入合适的培养管中 37℃培养 1 小时； 8．吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； 9．37℃培养过夜，观察结果。 附注： 1．利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低 （ 90mm 平板上不得超过 105 个菌落），同时 37 ℃ 培养不应超过 20 小时， 具氨苄青霉素抗性的转化体可将 β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周 围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 2．鉴定转化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有： ①α 互补； ②杂交筛选； ③插入失活（一些老质粒如 pBR322 等） ; ④小量提取质粒，并酶切或 PCR 检测 实验六 PCR 技术 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR ）是一种体外核酸扩增系统， 是分子克隆技术中的常用技术之一。 PCR 具有反应快速、灵敏、操作简便等优 点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。 实验目的： 掌握 PCR 原理，学习 PCR 操作过程 实验材料： 转基因水稻叶片总 DNA ，外源基因的特异引物 实验原理： PCR 是在模板 DNA、引物和 dNTPs 的存在下依赖于 DNA 聚合酶 的酶促反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变 性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异 DNA 片段 得到大量扩增。 实验步骤：