三、实验材料 小鼠(30克)取肝脏 四、实验器材 同实验七外加 eppendorf管、微量进样器、tp头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25moL蔗糖+O. olmo/LTs盐酸缓冲液 H74),乙醇:冰乙酸(3:1),生理盐水,姬姆萨染液,中性红一 詹纳斯绿染液(称取004g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于100ml, 0.25mo/L蔗糖溶液中)。 其中0.01mo/Tris一盐酸缓冲液配法:0 Imol/L三羟甲基氨 基甲烷(TIi)oml,0.lmo盐酸84ml加蒸馏水至100ml 六、实验步骤 1低速离心分离细胞核 (1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死,立即剪开腹部,迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污,用滤纸吸干。, (2)称取05g肝组织,放在小烧杯中剪碎,用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex离心管中,同时制 备1张滤液涂片,做好标记,自然干燥。 (4漓心机上500r/min离心5min(4℃),将上层溶液吸入2支 eppendof管中,盖紧盖子放在有冰块的器皿内,待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理 (5)用5m匀浆介质悬浮离心下的沉淀物,用吸管混匀,以 l00o/min离心 10min(4℃),吸去上清液,用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-05m匀浆介质 用吸管吹打成悬液,再制备一张涂片做好标记,自然干燥。 2.高速离心分离线粒体 (1)将步骤W4)中的 eppendof管在台式高速冷冻离心机上以 1000/min离心5min,缓缓吸出上清液至另2 eppendorf管,留 取沉淀物冰浴保存,待涂片鉴定。 (2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r/min离心 5mn。 66 三、实验材料 小鼠(30 克)取肝脏 四、实验器材 同实验七 外加 eppendorf 管、微量进样器、tip 头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25mol/L 蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液 pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳斯绿染液(称取 0.04g 中性红、0.02g 詹姆斯绿溶于 l00ml， 0.25mol/L 蔗糖溶液中)。 其中 0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：0.lmol/L 三羟甲基氨 基甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L 盐酸 8.4ml 加蒸馏水至 100ml。 六、实验步骤 1.低速离心分离细胞核 (1)将饥饿 24 小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。， (2)称取 0.5g 肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次。 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用 4 层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex 离心管中，同时制 备 l 张滤液涂片，做好标记，自然干燥。 (4 漓心机上 500r／min 离心 5min(4℃)，将上层溶液吸入 2 支 eppendof 管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理。 (5)用 5ml 匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以 1000r／min 离心 10min(4℃)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入 0.3-0.5ml 匀浆介质， 用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记， 自然干燥。 2. 高速离心分离线粒体 (1)将步骤 l(4)中的 eppendof 管在台式高速冷冻离心机上以 10000r／min 离心 5min，缓缓吸出上清液至另 2 eppendorf 管，留 取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。 (2) 另 2 支上清液在台式高速冷冻离心机上以 13000r／min 离心 5min