几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察 、实验目的 学会使用相差显微镜,掌握暗视野技术,以及荧光显微镜等技术 二、实验原理 在活细胞中,原生质流动是细胞活力强弱的重要标志,它的产生与 细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细,直径为5-6nm, 主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白,并像肌肉一样有收缩 功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的,位于原生质(静止 的)外质,紧靠在质膜之下,离运动的内质至少有1m的距离,与胞质 川流运动无关,主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输 的作用 另外,用秋水仙素与细胞松弛素B处理也可产生不同的结果。经 秋水仙素处理后,细胞的纤维被扰乱,但不影响川流运动,这是与秋水 仙素影响边缘微管作用有关。相反,用细胞松弛素B处理,就可抑制细 胞的川流运动,很明显,微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消 耗能量,也受温度、渗透压以及离子浓度的影响 三、实验材料 新鲜洋葱鳞茎,刚毛藻等。 四、实验器材 相差显微镜,普通光学显微镜,黑卡纸,载玻璃片,盖玻片,镊子,吸水 纸,剪刀,滴管,擦镜纸。 五、实验药品 100μg/ml秋水仙素溶液,20μg/m1细胞松弛素B( cytochalasin B),蒸馏水, 香玻油,二甲苯 六、实验步骤 1.取新鲜洋葱鳞茎内表皮约lcm2或更小,放在干净的载玻片上, 加一小滴水,将盖玻片倾斜盖上,并注意不出现气泡,即制成水封片。 取一块黑纸,把它剪成暗视野显微镜用的遮光板,并放入普通 光学显微镜的聚光器下的光阑上,制成暗视野显微镜。(须反复调整遮 光板的尺寸以得到最佳效果)。 把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察,可以 看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质 点”或颗粒,仔细观察,可以看出这些正作有向的运动(速度很慢)
1 几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察 一、实验目的 学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术 二、实验原理 在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与 细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为 5－6nm， 主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩 功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质（静止 的）外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有 1µm 的距离，与胞质 川流运动无关，主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输 的作用。 另外，用秋水仙素与细胞松弛素 B 处理也可产生不同的结果。经 秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰乱，但不影响川流运动，这是与秋水 仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素 B 处理，就可抑制细 胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消 耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。 三、实验材料 新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。 四、实验器材 相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水 纸，剪刀，滴管，擦镜纸。 五、实验药品 100µg/ml 秋水仙素溶液，20µg/ml 细胞松弛素 B(cytochalasin B)，蒸馏水， 香玻油，二甲苯。 六、实验步骤 1. 取新鲜洋葱鳞茎内表皮约 1cm2 或更小，放在干净的载玻片上， 加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。 2. 取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通 光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮 光板的尺寸以得到最佳效果）。 3. 把制成的水封片放在暗视野显微镜下用 10 倍物镜观察，可以 看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质 点”或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢）
水封片中多加些水会促进这种运动。 4.学习相差显微镜,荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有 关操作技术。 植物细胞骨架的光学显微镜观察 、实验目的 掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术,了解细胞骨架的 结构,学会制作永久封片 二、实验原理 当用适当浓度的 TritonX-100处理细胞时,因其非离子型表面活 性剂的特性,可以除去可溶性蛋白质和脂类,而微丝束属不可溶性蛋 白,就不会被 TritonX-100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝 R250染色时,在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨 架,在质膜下还能见到丝状骨架,骨架上常附着一些与膜运动、整合有 关的蛋白质。 考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝,但由于有些细胞骨 架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定,又因有些类型的纤维太细 而在光学显微镜下无法分辨,因此看到的是由微丝组成的纤维束,直径 约在40nm左右。 三、实验材料 新鲜洋葱鳞状叶。 四、实验器材 普通光学显微镜,50ml烧杯,滴管,试剂瓶,载玻片,盖玻片,镊子, 染色板,吸水纸,擦镜纸。 五、实验药品 1.M一缓冲液:所含各成分终浓度为50mmol/L眯唑,50mmol/L KCL,0.5mmol/ MGcL, Immol/ LEG TA(乙二醇双(a一氨基乙基》醚 四乙酸),0 1mmol/ L EDTA, Immol/L巯基乙醇或二硫苏糖醇 <DTT。lmol/LHCl调pH到68 2001moL磷酸缓冲液(pH68) 用0.2moL磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制 其中磷酸盐缓冲液配法:0.2 mol/LNa2HPO449ml 0.2mol/LNaH2 PO4 5lml 3.1% TrltonX-100,用M一缓冲液配制
2 水封片中多加些水会促进这种运动。 4. 学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有 关操作技术。 植物细胞骨架的光学显微镜观察 一、实验目的 掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的 结构，学会制作永久封片。 二、实验原理 当用适当浓度的 TritonX—100 处理细胞时，因其非离子型表面活 性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋 白，就不会被 TritonX—100 破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝 R250 染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨 架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有 关的蛋白质。 考马斯亮蓝 R250 并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨 架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细 而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径 约在 40nm 左右。 三、实验材料 新鲜洋葱鳞状叶。 四、实验器材 普通光学显微镜，50ml 烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子， 染色板，吸水纸，擦镜纸。 五、实验药品 1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为 50mmol／L 眯唑，50mmol／L KCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚 四乙酸)，0.1mmol／L EDTA，lmmol／L 巯基乙醇或二硫苏糖醇 <DTT)。lmol／L HCl 调 pH 到 6.8 2 0.01mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.8) 用 0.2mol/L 磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制 其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO4 49ml 0.2mol/LNaH2PO4 5lml 3. 1％TrltonX—100，用 M—缓冲液配制
4.0.2%考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为:甲醇:冰醋酸:水 (46.5:7:46.5) 5.3%戊二醛溶液,用901molL磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制 6.50%,70%,95%乙醇。 7.叔丁醇 8.正丁醇 9.二甲苯 10.中性树胶 六、实验步骤 1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小,取若干片,置于装有 68磷酸盐缓冲液的50m烧杯中,用镊子轻按入使其浸没5mi 2.吸去磷酸盐缓冲液,用1% TritonⅩ-100处理20-3omin。 3.吸去 TrironX-00液,用M缓冲液洗3次,每次10min左右。 4.用3%戊二醛固定0.5h 5.再用磷酸盐缓冲液洗3次,每次10mins 6.02%考马斯亮蓝R250染色20—30min(在染色板上)。 7.用蒸馏水洗1—2次,将样品置于载玻片上,在普通光学显微镜 下观察,先低倍,再高倍,最后用油镜 8.如观察结果较佳,可制作永久封片:在有样品的50m烧杯中, 依次用如下试剂处理:50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇,(1/2)V95%乙醇 +(1)V叔丁醇,叔丁醇(以上每个步骤反应5-10min)或正丁醇,正丁 醇,二甲苯,二甲苯(每个步骤5-10min)。然后,将样品置于载玻片上 展开,镜检后滴一滴中性树脂,盖上盖玻片。 叶绿体的分离与荧光观察 实验目的 掌握手工制作密度梯度技术,了解蔗糖密度梯度离心的原理及优 缺点
3 4．0.2％考马斯亮蓝 R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水 (46.5：7：46.5)。 · 5. 3％戊二醛溶液，用 9.01mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制 6. 50％，70％，95％乙醇。 7. 叔丁醇 8. 正丁醇 9. 二甲苯。 10.中性树胶。 六、实验步骤 1. 撕取洋葱鳞状叶内表皮约 lcm 大小，取若干片，置于装有 pH 6.8 磷酸盐缓冲液的 50ml 烧杯中，用镊子轻按入使其浸没 5min。 2．吸去磷酸盐缓冲液，用 l％TritonX—100 处理 20—30min。 3. 吸去 TrironX—i00 液，用 M-缓冲液洗 3 次，每次 10min 左右。 4. 用 3％戊二醛固定 0.5h。 5. 再用磷酸盐缓冲液洗 3 次，每次 10min。 6. 0.2％考马斯亮蓝 R250 染色 20—30min（在染色板上）。 7. 用蒸馏水洗 1—2 次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜 下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。 8. 如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的 50ml 烧杯中， 依次用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V 95％乙醇 +(1/2)V 叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应 5—10min)或正丁醇，正丁 醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤 5—10min)。然后，将样品置于载玻片上 展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上盖玻片。 叶绿体的分离与荧光观察 一、 实验目的 掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优 缺点
二、实验原理 用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度,在离心条件下,叶绿体和比它 沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处,而沉降系数较大的细胞组 分沉到离心管底部,这样,可粗略地分离叶绿体 实验材料 新鲜菠菜叶 四、实验器材 组织捣碎器,髙速冷冻离心机,普通离心机,离心管, Corex离心 管,烧杯,漏斗,纱布,载玻片,盖玻片,普通光学显微镜,剪刀,滴 管,荧光显微镜。 五、实验药品 匀浆介质(025mol/L蔗糖、0.05mol/ L Tris-HCi缓冲液, pH74):称取85.55g蔗糖,605 gRis,溶解在近800ml蒸馏水中,加 入约42.5 mIo.Imol/LHCI,最后蒸馏水定容至1000mnl 50%蔗糖溶液,15%蔗糖溶液。0.35M氯化钠,0.01%吖啶橙 六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心 1洗净菠菜叶,尽可能使它干燥,去除叶柄、主脉后,称取5g,剪 碎 2.加入预冷到近oC的匀浆介质10ml,在研钵内低温捣碎os 3.捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。 4!.滤液移入普通玻璃离心管,在普通离心机上1000r/min离心 lmin。 5.在2ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液和15%蔗糖溶液, 注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓注入,不能搅动50%蔗 糖液面,50%蔗糖溶液加0.9ml,15%蔗糖溶液加0.5π。加液完后, 可见两种溶液界面处折光稍有不同,这样密度梯度就制好了。 6.在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。 7.离心8000r/min,20min。 8.取出离心管,可见叶绿体在密度梯度液中间形成带;用滴管轻 轻吸出滴于载玻片上,盖上盖玻片,显微镜下观察。还可在暗室内用荧 光显微镜观察。 (二)菠菜叶手切片观察 用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上,滴加1~2 滴0.35mol/ NAcl溶液,加盖片后轻压,置显微镜下观察
4 二、 实验原理 用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它 沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组 分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。 三、 实验材料 新鲜菠菜叶 四、 实验器材 组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex 离心 管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴 管，荧光显微镜。 五、实验药品 匀浆介质(0.25mol／L 蔗糖、0.05mol／L Tris—HCi 缓冲液， pH7.4)：称取 85.55g 蔗糖，6.05gTris，溶解在近 800ml 蒸馏水中，加 入约 42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至 1000ml。 50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。0.35M 氯化钠，0.01％吖啶橙 六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心 l. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取 5g，剪 碎。 2. 加入预冷到近 0'C 的匀浆介质 10ml，在研钵内低温捣碎 o。 3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。 4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上 1000r／min 离心 1min。 5. 在 2ml 离心管内依次加入 50％蔗糖溶液和 15％蔗糖溶液， 注意要用滴管吸取 15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动 50％蔗 糖液面，50％蔗糖溶液加 0.9ml，15％蔗糖溶液加 0.5ml。加液完后， 可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。 6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入 0.3ml 上清液。 7．离心 8000r／min，20min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻 轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。还可在暗室内用荧 光显微镜观察。 (二)菠菜叶手切片观察 用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加 1～2 滴 0.35mol／LNaCl 溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察
(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察 (3)用同样方法制片,但滴加1~2滴001%吖啶橙染液染色 lmin,洗去余液,加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 七、实验结果 (一)叶绿体的分离和观察 1.普通光镜下,可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看 到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒,即基粒。 2.以 Olympus荧光显微镜为例,在选用B《blue》激发滤片、B 双向色镜和0-530阻断滤片的条件下,叶绿体发出火红色荧 3.加入吖啶橙染色后,叶绿体可发出桔红色荧光,而其中混 有的细胞核则发绿色荧光。 (二)菠菜叶手切片观察 1.在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞:为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 (2)保卫细胞:为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3)叶肉细胞:为排成栅状的长形和椭园形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形,在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。 2.在荧光显微镜下,叶绿体发出火红色荧光,但其荧光强度 要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光,两保卫细胞内的火红色叶绿 体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞 3.用吖啶橙染色后,叶绿体则发出桔红色荧光,细胞核可发 绿色荧光,气孔仍为绿色。 细胞组分的分离 、实验目的 掌握分级分离方法 实验原理 利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异,可采取分级 差速离心的方法,将各组分逐级分离出来
5 (1) 在普通光镜下观察· (2)在荧光显微镜下观察 (3)用同样方法制片，但滴加 1～2 滴 0.01％吖啶橙染液染色 lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 七、实验结果 (一)叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形在高倍镜下可看 到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 以 Olympus 荧光显微镜为例，在选用 B《blue》激发滤片、B 双向色镜和 0-530 阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧 光。 3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混 有的细胞核则发绿色荧光。 （二）菠菜叶手切片观察 1．在普通光镜下可以看到三种细胞 ， (1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。 (2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭园形细胞。 叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下带可以看到绿色的基粒。 2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度 要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿 体侧环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞 少。 3．用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发 绿色荧光，气孔仍为绿色。 细胞组分的分离 一、实验目的 掌握分级分离方法。 二、实验原理 利用细胞内各组分在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级 差速离心的方法，将各组分逐级分离出来
三、实验材料 小鼠(30克)取肝脏 四、实验器材 同实验七外加 eppendorf管、微量进样器、tp头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25moL蔗糖+O. olmo/LTs盐酸缓冲液 H74),乙醇:冰乙酸(3:1),生理盐水,姬姆萨染液,中性红一 詹纳斯绿染液(称取004g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于100ml, 0.25mo/L蔗糖溶液中)。 其中0.01mo/Tris一盐酸缓冲液配法:0 Imol/L三羟甲基氨 基甲烷(TIi)oml,0.lmo盐酸84ml加蒸馏水至100ml 六、实验步骤 1低速离心分离细胞核 (1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死,立即剪开腹部,迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污,用滤纸吸干。, (2)称取05g肝组织,放在小烧杯中剪碎,用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex离心管中,同时制 备1张滤液涂片,做好标记,自然干燥。 (4漓心机上500r/min离心5min(4℃),将上层溶液吸入2支 eppendof管中,盖紧盖子放在有冰块的器皿内,待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理 (5)用5m匀浆介质悬浮离心下的沉淀物,用吸管混匀,以 l00o/min离心 10min(4℃),吸去上清液,用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-05m匀浆介质 用吸管吹打成悬液,再制备一张涂片做好标记,自然干燥。 2.高速离心分离线粒体 (1)将步骤W4)中的 eppendof管在台式高速冷冻离心机上以 1000/min离心5min,缓缓吸出上清液至另2 eppendorf管,留 取沉淀物冰浴保存,待涂片鉴定。 (2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r/min离心 5mn。 6
6 三、实验材料 小鼠(30 克)取肝脏 四、实验器材 同实验七 外加 eppendorf 管、微量进样器、tip 头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25mol/L 蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液 pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳斯绿染液(称取 0.04g 中性红、0.02g 詹姆斯绿溶于 l00ml， 0.25mol/L 蔗糖溶液中)。 其中 0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：0.lmol/L 三羟甲基氨 基甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L 盐酸 8.4ml 加蒸馏水至 100ml。 六、实验步骤 1.低速离心分离细胞核 (1)将饥饿 24 小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。， (2)称取 0.5g 肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次。 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用 4 层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex 离心管中，同时制 备 l 张滤液涂片，做好标记，自然干燥。 (4 漓心机上 500r／min 离心 5min(4℃)，将上层溶液吸入 2 支 eppendof 管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理。 (5)用 5ml 匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以 1000r／min 离心 10min(4℃)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入 0.3-0.5ml 匀浆介质， 用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记， 自然干燥。 2. 高速离心分离线粒体 (1)将步骤 l(4)中的 eppendof 管在台式高速冷冻离心机上以 10000r／min 离心 5min，缓缓吸出上清液至另 2 eppendorf 管，留 取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。 (2) 另 2 支上清液在台式高速冷冻离心机上以 13000r／min 离心 5min
(3)吸去上清液,沉淀物置冰浴中,待制片鉴定时用。 3.分离物的鉴定 (1)细胞核。将步骤1中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定 l5min,吹干,滴姬姆萨染液(原液用1/15mol磷酸缓冲液 稀释10-20倍)染色10min,自来水冲洗,吹干,在高倍镜 下比较观察涂片 (2)线粒体。在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红一詹纳斯 绿染液,取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片 上,染色3min后分别盖上盖玻片,在高倍镜下观察。附:更精致的分离方 案 将45ml0.34mol/L蔗糖溶液放入离心管,然后沿壁小心地加入 45ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700×g离心 l0min,得上清液Ⅰ和沉淀物。沉淀物用10ml0.25mol/L蔗糖溶液洗2 次,每次1000×g离心10min,得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集 质膜:吸出沉淀中较疏松的上层,混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中,沿 管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层,经700 ×g离心10min,质膜最终集中在两溶液界面上,吸出质膜层。(2)细胞 核纯化:将沉淀用5倍体积的0.34mol/L蔗糖0.5mo/LMg(Ac)溶 液混悬,铺在4倍于核悬液体积的0.88m0I/L蔗糖-0.5mol/L Mg(Ac)2溶液之上,1500×g离心20min,沉淀物即为纯化的细胞核。 (3)分离核仁:纯化的细胞核混悬在2倍体积的034mol/L蔗糖一 0.5mol/LMg(Ac)溶液中,超声波破核膜,释放出核仁,注意蔗糖介质 pH中性或弱碱性时核膜才易破碎,超声后的悬液铺于4倍体积的 0.88mol/L蔗糖—0.5mol/LMg(Ac)溶液之上,1700×g离心17min 沉淀物即为核仁,溶液为上清液I。 将上清液I10000Xg离心 lOmin得上清液Ⅱ和沉淀物,沉淀物以 IOml预冷的025mol/L蔗糖溶液洗2次,每次10000×g离心10min, 得沉淀物即为纯化的线粒体。 上清液Ⅱ经16300×g离心20min得上清液Ⅲ和沉淀物,沉淀物 以Iom预冷的0.25m01/L蔗糖溶液洗:16300×g离心20min,得沉淀 物即为纯化的溶酶体。 上清液Ⅲ经100000Xg离~30min,得沉淀物(为微粒体)和上清 液Ⅳ,后者再经离心150000×g3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分 子等
7 (3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。 3．分离物的鉴定 (1)细胞核。将步骤 l 中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定 15min，吹干，滴姬姆萨染液(原液用 1／15mol 磷酸缓冲液 稀释 10—20 倍)染色 10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜 下比较观察涂片。 (2)线粒体。在 2 张干净载玻片中央各滴 2—3 滴中性红—詹纳斯 绿染液，取步骤 2 高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片 上，染色 30min 后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。附：更精致的分离方 案 将 4.5ml0.34mol／L 蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入 4.5ml 鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以 700×g 离心 10min，得上清液 I 和沉淀物。沉淀物用 10ml 0.25mol／L 蔗糖溶液洗 2 次，每次 1000×g 离心 10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集 质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为 1.16 的蔗糖溶液中，沿 管壁小心加入已放在离心管中的比重 1.18 的蔗糖溶液的上层，经 700 ×g 离心 10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。（2）细胞 核纯化：将沉淀用 5 倍体积的 0.34mol／L 蔗糖 0.5mol／LMg(Ac)2 溶 液混悬，铺在 4 倍于核悬液体积的 0.88m01'／L 蔗糖—0.5mol／L Mg(Ac)2 溶液之上，1500×g 离心 20min，沉淀物即为纯化的细胞核。 （3）分离核仁：纯化的细胞核混悬在 2 倍体积的 0.34mol／L 蔗糖— 0.5mol／LMg(Ac)2 溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质 pH 中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于 4 倍体积的 0.88mol／L 蔗糖—0.5moI／LMg(Ac)2 溶液之上，1700×g 离心 17min。 沉淀物即为核仁，溶液为上清液 I。 将上清液 I 10000×g 离心 lOmin 得上清液Ⅱ和沉淀物，沉淀物以 lOml 预冷的 0.25mol／L 蔗糖溶液洗 2 次，每次 10000×g 离心 10min， 得沉淀物即为纯化的线粒体。 上清液Ⅱ经 16 300×g 离心 20min 得上清液Ⅲ和沉淀物，沉淀物 以 lOml 预冷的 0.25m01／L 蔗糖溶液洗；16300×g 离心 20min，得沉淀 物即为纯化的溶酶体。 上清液Ⅲ经 100 000Xg 离~~'30min，得沉淀物(为微粒体)和上清 液Ⅳ，后者再经离心 150000×g 3h 左右可获得核糖体、病毒、生物大分 子等
四膜虫纤毛的再生 、背景和原理 纤毛和鞭毛是细胞表面的特化结构,具有运动功能。纤毛和鞭毛的结构基本相同。纤毛 轴心含有一束“9+2”排列的平行微管,中央微管均为完全微管,外围二联体微管由A,B 亚纤维组成,A亚纤维为完全微管,由13个球形亚基环绕而成,B亚纤维仅由10个亚基构 成,另3个亚基与A亚纤维共用(图9-16)。 连丝蛋白 动力蛋白臂 放射轴条 中央单体微管 100rm A亚纤维B亚纤雏 外周双联体 图9-16纤毛结构模式图 a)纤毛檳切面;b)微管二联体及附属结构 微管是由微管蛋白组成的管状结构,对低温、高压和秋水仙素敏感。 大多数微管纤维处于动态的组装和去组装状态,这是实现其功能所必需的过程 本实验以 Rosenbaum和 Carlson(1969)的实验为基础,在降低pH和钙离子存在的条件 下通过机械修剪的方法,在膜水平脱去四膜虫的纤毛,剩下肿胀的,不能运动的细胞。在不 同的生长温度(25℃和17℃)下观察纤毛的再生率,并且在不同的抑制物的作用下研究微 管亚单位的合成和组装。 、实验目的 1.使用相差显微镜和血球计数器; 2.了解微管组装的基本原理 、教学安排 学时数:3-4小时
8 四膜虫纤毛的再生 一、背景和原理 纤毛和鞭毛是细胞表面的特化结构，具有运动功能。纤毛和鞭毛的结构基本相同。纤毛 轴心含有一束“9＋2”排列的平行微管，中央微管均为完全微管，外围二联体微管由 A，B 亚纤维组成，A 亚纤维为完全微管，由 13 个球形亚基环绕而成，B 亚纤维仅由 10 个亚基构 成，另 3 个亚基与 A 亚纤维共用(图 9-16)。 微管是由微管蛋白组成的管状结构，对低温、高压和秋水仙素敏感。 大多数微管纤维处于动态的组装和去组装状态，这是实现其功能所必需的过程。 本实验以 Rosenbaum 和 Carlson（1969）的实验为基础，在降低 pH 和钙离子存在的条件 下通过机械修剪的方法，在膜水平脱去四膜虫的纤毛，剩下肿胀的，不能运动的细胞。在不 同的生长温度（25℃和 17℃）下观察纤毛的再生率，并且在不同的抑制物的作用下研究微 管亚单位的合成和组装。 二、实验目的 1．使用相差显微镜和血球计数器； 2．了解微管组装的基本原理 三、教学安排 学时数：3－4 小时
四、实验仪器、器材与试剂 1.材料:梨形四膜虫。 2.仪器:锥形瓶,相差显微镜,血细胞计数器,台式离心机,滴管,注射器, parafilm 膜,载玻片,盖玻片,定时器。 3.试剂:蛋白胨,亚胺环己酮,新霉素,秋水仙碱,EDIA,醋酸钠,氯化钙 五、实验方法与步骤 1、分别将250毫升含1%蛋白胨四膜虫培养物置于500毫升锥形瓶中于25℃和17℃培 养。(时间) 2、两瓶培养物分别800g离心10分钟,重新悬浮于15毫升1%蛋白胨溶液,置于50 毫升锥形瓶,做好标记。 3、准备2个50毫升锥形瓶,各加入15毫升1%蛋白胨溶液;3个100毫升锥形瓶,含 20毫升1%蛋白胨溶液,分别加入10微克/升亚胺环己酮:50微克升亚新霉素:加入2毫 克/升秋水仙碱 4、以下操作在冰浴上进行: )在零时间,用一个大试管在冰浴上将25毫升浓缩的四膜虫悬液(生长于25℃)加 至5毫升介质A(10mDTA·2Na;50wM醋酸钠;pH6.0)中,搅拌混匀。 2)30秒后加入2.5毫升预冷的蒸馏水。 3)1分钟后加入0.25毫升预冷的0. 2Mcacl, parafilm膜封口,倒转试管使之混合。 4)2分钟后用装有19号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中(修剪掉四膜虫的 纤毛)。迅速用滴灌取少量悬液,滴加在载玻片上镜检,观察其是否失去运动性 5)去纤毛后,立即把1毫升去纤毛的细胞加至20毫升1%蛋白胨溶液,25℃预热的100 毫升锥形瓶中,于25℃培养并开始实验。 5、每隔10分钟取出定量的样品,对其随时间变化的能动性( motility)%进行分析。由 于脱纤毛的细胞不能运动,切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察,估计运动细 胞和非运动细胞的数目。制备快速标本,在相差显微镜下观察细胞是否肿胀,有无新生纤毛 等情况。 6、同时对生长于17℃的四膜虫进行脱纤毛,并同在25℃的四膜虫的纤毛再生时间比 较 7、从生长于25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞,在分别加入亚胺环己酮,新霉
9 四、实验仪器、器材与试剂 1．材料：梨形四膜虫。 2．仪器：锥形瓶，相差显微镜，血细胞计数器，台式离心机，滴管，注射器，parafilm 膜，载玻片，盖玻片，定时器。 3．试剂：蛋白胨，亚胺环己酮，新霉素，秋水仙碱，EDTA，醋酸钠，氯化钙。 五、实验方法与步骤 1、 分别将 250 毫升含 1%蛋白胨四膜虫培养物置于 500 毫升锥形瓶中于 25℃和 17℃培 养。（时间） 2、 两瓶培养物分别 800g 离心 10 分钟，重新悬浮于 15 毫升 1%蛋白胨溶液，置于 50 毫升锥形瓶，做好标记。 3、 准备 2 个 50 毫升锥形瓶，各加入 15 毫升 1%蛋白胨溶液；3 个 100 毫升锥形瓶，含 20 毫升 1%蛋白胨溶液，分别加入 10 微克/升亚胺环己酮；50 微克/升亚新霉素；加入 2 毫 克/升秋水仙碱。 4、 以下操作在冰浴上进行： 1） 在零时间，用一个大试管在冰浴上将 2.5 毫升浓缩的四膜虫悬液（生长于 25℃）加 至 5 毫升介质 A（10mMEDTA·2Na; 50mM 醋酸钠；pH6.0）中，搅拌混匀。 2） 30 秒后加入 2.5 毫升预冷的蒸馏水。 3） 1 分钟后加入 0.25 毫升预冷的 0.2McaCl2, parafilm 膜封口，倒转试管使之混合。 4） 2 分钟后用装有 19 号针头的注射器吸取悬液并注入预冷的试管中（修剪掉四膜虫的 纤毛）。迅速用滴灌取少量悬液，滴加在载玻片上镜检，观察其是否失去运动性。 5） 去纤毛后，立即把 1 毫升去纤毛的细胞加至 20 毫升 1%蛋白胨溶液，25℃预热的 100 毫升锥形瓶中，于 25℃培养并开始实验。 5、 每隔 10 分钟取出定量的样品，对其随时间变化的能动性（motility）%进行分析。由 于脱纤毛的细胞不能运动，切记在取样前振荡锥形瓶。在血细胞计数器上观察，估计运动细 胞和非运动细胞的数目。制备快速标本，在相差显微镜下观察细胞是否肿胀，有无新生纤毛 等情况。 6、 同时对生长于 17℃的四膜虫进行脱纤毛，并同在 25℃的四膜虫的纤毛再生时间比 较。 7、 从生长于 25℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉
素,秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱 纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样,观察其反应是否发生改变 8、从生长于17℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞,在分别加入亚胺环己酮,新霉 素,秋水仙碱和空白对照的含20毫升的1%蛋白胨溶液100毫升锥形瓶中各加入1毫升脱 纤毛细胞。每隔10分钟分别从瓶中取样,观察其反应是否发生改变。 9、从生长于25℃的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。对下列各个瓶中分别 加入1ml脱纤毛细胞: (i)蛋白胨+10μg/ml亚胺环己酮 (i)蛋白胨+50μg/ml新霉素 (ⅲi)蛋白胨+2mg/ml秋水仙碱 (ⅳv)只含蛋白胨作为对照 每隔10分钟从瓶中取样。让实验进行尽可能长的时间,以便观察其反应是否发生改变。 记录结果 实验结果以能动性(%)对时间(min)作图表示: (1)生长于25℃和17℃的四膜虫 (2)抑制物对纤毛再生的效应 讨论 作为这一实验的引伸,还可以应用更多的抑制物来表明,是否需要生成新的信息性分 子,细胞周期中的不同时相是否起重要作用?对抑制物的观察可以时可逆的,因为经过一个 时间阶段后,细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。这些实验着眼于纤毛的再生系统, 在这些系统中很容易辨认出重点。这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提 供资料。 六、实验提示与注意事项 1梨形四膜虫的纯培养可培养于1%蛋白胨(1%蛋白胨:0.25%酵母浸膏),培养液用 15磅时2高压灭菌15分钟。在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术,但在课堂实验 时无需应用无菌采样技术。为了获得实验所需数量的培养物,含250m蛋白胨的500ml锥 形瓶在25℃可培养1-2天,而在17℃需2-3天。这一体积的培养物可用来接种25瓶新的 250ml培养物
10 素，秋水仙碱和空白对照的含 20 毫升的 1%蛋白胨溶液 100 毫升锥形瓶中各加入 1 毫升脱 纤毛细胞。每隔 10 分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。 8、 从生长于 17℃的四膜虫悬液制备新鲜脱纤毛的细胞，在分别加入亚胺环己酮，新霉 素，秋水仙碱和空白对照的含 20 毫升的 1%蛋白胨溶液 100 毫升锥形瓶中各加入 1 毫升脱 纤毛细胞。每隔 10 分钟分别从瓶中取样，观察其反应是否发生改变。 9、 从生长于 25℃的浓缩四膜虫悬液制备一些新鲜的脱纤毛细胞。对下列各个瓶中分别 加入 1ml 脱纤毛细胞： （i）蛋白胨＋10µg/ml 亚胺环己酮 （ii）蛋白胨＋50µg/ml 新霉素 （iii）蛋白胨＋2mg/ml 秋水仙碱 （iv）只含蛋白胨作为对照 每隔 10 分钟从瓶中取样。让实验进行尽可能长的时间，以便观察其反应是否发生改变。 记录结果 实验结果以能动性（％）对时间（min）作图表示： （1）生长于 25℃和 17℃的四膜虫； （2）抑制物对纤毛再生的效应。 讨论 作为这一实验的引伸，还可以应用更多的抑制物来表明，是否需要生成新的信息性分 子，细胞周期中的不同时相是否起重要作用？对抑制物的观察可以时可逆的，因为经过一个 时间阶段后，细胞可以克服由于秋水仙碱引起的组装阻断。这些实验着眼于纤毛的再生系统， 在这些系统中很容易辨认出重点。这些实验还为诸如纤毛和鞭毛等微管结构的合成和组装提 供资料。 六、实验提示与注意事项 1.梨形四膜虫的纯培养可培养于 1％蛋白胨（1％蛋白胨；0.25％酵母浸膏），培养液用 15 磅/时 2 高压灭菌 15 分钟。在接种培养物和整个培养过程中需用无菌技术，但在课堂实验 时无需应用无菌采样技术。为了获得实验所需数量的培养物，含 250ml 蛋白胨的 500ml 锥 形瓶在 25℃可培养 1－2 天，而在 17℃需 2－3 天。这一体积的培养物可用来接种 25 瓶新的 250ml 培养物
