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第8期 王素琴等：小球藻USTB01的异养培养和叶黄素的生产 .767. 20min灭菌后使用，在洁净工作台内接种小球藻后， 合作用和生长，因此黑暗异养培养小球藻尤其是在 在光照培养箱或振荡恒温培养箱中进行培养，光照 高细胞初始浓度下显示出了非常大的优势和潜力· 培养条件是：30℃，2h光照黑暗循环，光照度 25 3000x,每天摇瓶2次；黑暗培养条件是：30℃，摇 ■一限暗 床转速为200rmin-1. 光照 1.3小球藻生物量的测定 10 用分光光度计在波长680nm下测定光密度 (D680)以示小球藻的生长量，按照如下公式可计算 出对应的小球藻细胞干质量浓度： 时间/d y=0.3571x-0.0027, 图1不同培养方式对小球藻生长的影响 式中，x为D6s0y为藻细胞干质量浓度，gL-1山. Fig.1 Effect of culture condition on the growth of Chlorella sp 1.4叶黄素的提取及检测 在小球藻培养结束时，取5mL藻液，离心 2.2小球藻细胞提取液中叶黄素的识别 (10000rmin-1,10min)后倒去上清液，沉降于离 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液的HPLC 心管底部的藻细胞用磷酸盐缓冲溶液(H=7.0)重 谱图（图2）显示，标准品叶黄素出峰的保留时间为 新悬浮后再次离心倒去上清液，如此重复三次清洗 3.06min,小球藻细胞提取液在同样的保留时间也 藻细胞后，加入5mL甲醇二氯甲烷（体积比2：1） 存在一个明显的出峰（图2(a)),因此初步确认筛选 溶液，用超声波细胞破碎机破碎藻细胞20min(超声 的小球藻种能够产生叶黄素，为了更进一步确认在 10s,间隔2s)后，再次经过离心(10000rmin1, 藻细胞提取液中与标准品叶黄素有着同样保留时间 l0min)取上清液在HPLC上测定.实验前用甲醇 的出峰就是叶黄素，分别对叶黄素标准品的出峰以 二氯甲烷（体积比2：1）配制叶黄素质量浓度分别为 及在藻提取液中与之有相同保留时间的出峰从 4,8,12,16,20mgL的标准溶液，依次在HPLC 375nm到800nm进行吸收扫描.结果显示，标准品 上进行测定，得到叶黄素峰高(y1)与叶黄素质量浓 叶黄素与藻细胞提取液中的出峰的光谱图基本相同 度(x1)的一元线性回归方程(y1=4.0408x1一 (图2(b),最大吸收波长均为447nm左右，因此证 0.8169,决定系数r2=0.9987).实验通过叶黄素 实小球藻中确实含有叶黄素， 峰高计算出对应的叶黄素浓度.叶黄素含量测定条 件是：高效液相色谱(HPLC)仪（岛津LC一1 OATvp 150 ⊙ 泵，SPD一M10AVP二极管阵列检测器)，Zorbax SB一 :标准品 出峰 C18(4.6mm×25cm)分离柱，流动相是乙腈- 100 甲醇-乙酸乙酯（体积比45：10：45），流速为1 小球藻提取 mL'min-1,进样量20L,检测波长为460nm. 物出峰 2结果与讨论 4 6 8 10 2.1小球藻光照与黑暗培养比较 保阐时间/min 500A 图1为不同接种量下，光照与黑暗培养小球藻 6 400 生长的比较.从图中可以看出，当接种量较低时（初 相似系数0.999906 始D8为0.1)，无论是光照还是黑暗培养，小球藻 300 实线一叶黄素标准品 虚线一小球藻提取物 生长都非常缓慢，延迟期达到3d以上，当增大初始 200 藻生物量（初始D680为1.5）后，在黑暗培养条件下， 100 小球藻迅速进入对数生长期，几乎没有延迟期，第2 400450500550600650700750800 天就达到了最大生物量，这与文献[14]得到的结果 波长mm 基本相同，在高初始藻生物量培养条件下，黑暗异 图2叶黄素标准品及小球藻细胞提取液谱图.()HPLC图谱： 养培养小球藻的生长速度远远高于光照培养；其原 (b)扫描图谱 因主要是因为在光照条件下，随着藻细胞浓度的增 Fig.2 Standard lutein and cell-free extract of Chlorella sp:(a) 加，细胞之间会发生相互遮掩现象，影响了藻类的光 HPLC profile;(b)scan profile20min灭菌后使用．在洁净工作台内接种小球藻后 在光照培养箱或振荡恒温培养箱中进行培养光照 培养条件是：30℃2h 光照黑 暗 循 环光 照 度 3000lx每天摇瓶2次；黑暗培养条件是：30℃摇 床转速为200r·min －1． 1∙3 小球藻生物量的测定 用分光光度计在波长680nm 下测定光密度 （ D680）以示小球藻的生长量．按照如下公式可计算 出对应的小球藻细胞干质量浓度： y＝0∙3571x－0∙0027 式中x 为 D680；y 为藻细胞干质量浓度g·L －1［11］． 1∙4 叶黄素的提取及检测 在小球藻培养结束时取 5mL 藻液离心 （10000r·min －110min）后倒去上清液沉降于离 心管底部的藻细胞用磷酸盐缓冲溶液（pH＝7∙0）重 新悬浮后再次离心倒去上清液如此重复三次清洗 藻细胞后加入5mL 甲醇－二氯甲烷（体积比2∶1） 溶液用超声波细胞破碎机破碎藻细胞20min（超声 10s间隔2s）后再次经过离心（10000r·min －1 10min）取上清液在 HPLC 上测定．实验前用甲醇－ 二氯甲烷（体积比2∶1）配制叶黄素质量浓度分别为 48121620mg·L －1的标准溶液依次在 HPLC 上进行测定得到叶黄素峰高（ y1）与叶黄素质量浓 度（ x1） 的一元线性回归方程（ y1＝4∙0408x1－ 0∙8169决定系数 r 2＝0∙9987）．实验通过叶黄素 峰高计算出对应的叶黄素浓度．叶黄素含量测定条 件是：高效液相色谱（HPLC）仪（岛津 LC－10ATvp 泵SPD－M10Avp 二极管阵列检测器）Zorbax SB－ C18（●4∙6mm ×25cm） 分离柱流动相是乙 腈－ 甲醇－乙酸乙酯 （体 积 比 45∶10∶45）流 速 为 1 mL·min －1进样量20μL检测波长为460nm． 2 结果与讨论 2∙1 小球藻光照与黑暗培养比较 图1为不同接种量下光照与黑暗培养小球藻 生长的比较．从图中可以看出当接种量较低时（初 始 D680为0∙1）无论是光照还是黑暗培养小球藻 生长都非常缓慢延迟期达到3d 以上．当增大初始 藻生物量（初始 D680为1∙5）后在黑暗培养条件下 小球藻迅速进入对数生长期几乎没有延迟期第2 天就达到了最大生物量这与文献［14］得到的结果 基本相同．在高初始藻生物量培养条件下黑暗异 养培养小球藻的生长速度远远高于光照培养；其原 因主要是因为在光照条件下随着藻细胞浓度的增 加细胞之间会发生相互遮掩现象影响了藻类的光 合作用和生长因此黑暗异养培养小球藻尤其是在 高细胞初始浓度下显示出了非常大的优势和潜力． 图1 不同培养方式对小球藻生长的影响 Fig．1 Effect of culture condition on the growth of Chlorella sp 2∙2 小球藻细胞提取液中叶黄素的识别 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液的 HPLC 谱图（图2）显示标准品叶黄素出峰的保留时间为 3∙06min小球藻细胞提取液在同样的保留时间也 存在一个明显的出峰（图2（a））因此初步确认筛选 的小球藻种能够产生叶黄素．为了更进一步确认在 藻细胞提取液中与标准品叶黄素有着同样保留时间 的出峰就是叶黄素分别对叶黄素标准品的出峰以 及在藻提取液中与之有相同保留时间的出峰从 375nm到800nm 进行吸收扫描．结果显示标准品 叶黄素与藻细胞提取液中的出峰的光谱图基本相同 （图2（b））最大吸收波长均为447nm 左右因此证 实小球藻中确实含有叶黄素． 图2 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液谱图．（a） HPLC 图谱； （b） 扫描图谱 Fig．2 Standard lutein and cel-l free extract of Chlorella sp： （a） HPLC profile；（b） scan profile 第8期 王素琴等： 小球藻 USTB01的异养培养和叶黄素的生产 ·767·