D0I:10.13374/1.issnl00103.2007.08.0B 第29卷第8期 北京科技大学学报 Vol.29 No.8 2007年8月 Journal of University of Science and Technology Beijing Aug.2007 小球藻USTB01的异养培养和叶黄素的生产 王素琴12)李雅雯3)闫海)杨帅) 林海) 1)北京科技大学应用科学学院，北京1000832)北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 3)北京航空航天大学生物工程系，北京100083 摘要研究了异养无光照条件下不同碳源，氮源和碳氮质量比对小球藻生长及叶黄素产生的影响。结果表明，葡萄糖和硝 酸钾分别是支持小球藻USTB01持续快速生长的最佳碳源和氮源.以葡萄糖和硝酸钾分别作为唯一碳源和氨源时，在初始氨 质量浓度都为0.28gL-情况下，碳氮质量比为25：1是促进小球藻生长的优化控制条件.硝酸钾是促进小球藻USTB01叶 黄素生物合成的最佳氨源，但在碳氮质量比从15到30的范围内，小球藻细胞中叶黄素含量随碳氮质量比的升高而降低· 关键词小球藻：异养培养：叶黄素：碳源：氮源：碳氮比 分类号Q914.82 微藻中的小球藻富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂 养培养研究还处在萌芽阶段]，未见有能够达到 肪酸、色素和多种维生素山，具有极高的营养价值 如此超高细胞浓度藻类培养的研究与产业化报道， 和提高免疫力的功能，是一种具有多方面经济价值 美国、日本和以色列等国家已实现小球藻的产业化 的生物资源，有着巨大的应用和开发潜力·据报道 生产，年产量约为1500~2000t,而国际市场的年需 小球藻细胞中所含的类胡萝卜素主要以叶黄素为 求量约为8000~10000t.笔者在国内率先筛选出 主，质量分数可达0.267%~0.31%2]，而作为传统 了能够异养生长小球藻种并研究了光照条件下不同 叶黄素源的紫苜蓿中叶黄素也仅为0.02%~ 氨源形态和植物激素对其生长的影响一13]，本文主 0.03%[3).目前研究发现叶黄素主要有以下几种功 要对小球藻在不同培养条件下细胞中叶黄素含量的 能可：利用其着色剂作为饲料及食品添加剂：作为 变化进行了研究，旨在为充分利用小球藻生产叶黄 其他物质的稳定剂；防止老年人视黄斑退化：抗癌作 素等重要生命活性物质提供科学依据和技术储备· 用：对心脑血管疾病有防治作用.随着科技的进一 步发展，小球藻作为新的叶黄素来源必然越来越受 1实验材料与研究方法 到人们的普遍重视. 1.1实验材料 小球藻细胞除了可以利用光能和二氧化碳进行 实验用小球藻藻种是从天然水体中筛选出的小 正常的自养生长外，某些特殊的小球藻种还可以在 球藻纯种山，实验用含碳化合物包括碳酸氢钠、葡 异养无光照培养条件下利用有机碳源进行生长和繁 萄糖、乙酸钠和乙醇。含氮化合物包括硝酸钾、氯化 殖[].异养培养小球藻可以克服光照自养培养藻 铵、尿素，所用试剂均为分析纯。实验用叶黄素标 生物量低等诸多缺陷，是提高小球藻产量与产率的 准品购自北京禹光生物科学研究中心 有效途径.Kyle等I町筛选到一株Crypthecoainium 1.2培养基和培养条件 藻，其异养培养60~90h后藻细胞干质量浓度可达 小球藻所用的基础培养基见文献[11]，在不同 40g·L;另外筛选到的一株菱形藻(Nitzschi- 碳源形态实验中，分别以碳酸氢钠、葡萄糖、乙酸钠 a)10,异养培养64h生物量可达45~48gL-1.闫 和乙醇作为唯一碳源，在不同氮源实验中，分别以 海等山在国内成功筛选出能够异养生长的小球藻 硝酸钾、氯化铵和尿素作为唯一氮源，在不同碳氨 种USTB01,异养批量培养96h藻细胞干质量浓度 质量比实验中，碳氨源分别选择葡萄糖和硝酸钾，初 可以达到30gL左右·目前，我国微藻高密度异 始硝酸钾质量浓度为2gL-1,通过改变葡萄糖添加 收稿日期：2006-02-27修回日期：2006-12-07 量，使碳氮质量比分别为15：1,20：1,251,30：1.培 基金项目：国家自然科学基金资助项目(N0,20377047):北京科技 养基初始pH值都调至6.5左右，实验器皿为 大学大学生创新基金资助项目 300mL三角瓶，培养量为100mL·培养基和实验器 作者简介：王素琴(1982一)，女，硕士研究生：闫海(1962一)，男， 教授 皿均经121℃的高温和超净工作台紫外灯照射
小球藻 USTB01的异养培养和叶黄素的生产 王素琴12） 李雅雯3） 闫 海1） 杨 帅2） 林 海2） 1） 北京科技大学应用科学学院北京100083 2） 北京科技大学土木与环境工程学院北京100083 3） 北京航空航天大学生物工程系北京100083 摘 要 研究了异养无光照条件下不同碳源、氮源和碳氮质量比对小球藻生长及叶黄素产生的影响．结果表明葡萄糖和硝 酸钾分别是支持小球藻 USTB01持续快速生长的最佳碳源和氮源．以葡萄糖和硝酸钾分别作为唯一碳源和氮源时在初始氮 质量浓度都为0∙28g·L －1情况下碳氮质量比为25∶1是促进小球藻生长的优化控制条件．硝酸钾是促进小球藻 USTB01叶 黄素生物合成的最佳氮源但在碳氮质量比从15到30的范围内小球藻细胞中叶黄素含量随碳氮质量比的升高而降低． 关键词 小球藻；异养培养；叶黄素；碳源；氮源；碳氮比 分类号 Q914∙82 收稿日期：2006-02-27 修回日期：2006-12-07 基金项目：国家自然科学基金资助项目（No．20377047）；北京科技 大学大学生创新基金资助项目 作者简介：王素琴（1982－）女硕士研究生；闫 海（1962－）男 教授 微藻中的小球藻富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂 肪酸、色素和多种维生素［1］具有极高的营养价值 和提高免疫力的功能是一种具有多方面经济价值 的生物资源有着巨大的应用和开发潜力．据报道 小球藻细胞中所含的类胡萝卜素主要以叶黄素为 主质量分数可达0∙267％～0∙31％［2］而作为传统 叶黄 素 源 的 紫 苜 蓿 中 叶 黄 素 也 仅 为 0∙02％ ～ 0∙03％［3］．目前研究发现叶黄素主要有以下几种功 能［4－6］：利用其着色剂作为饲料及食品添加剂；作为 其他物质的稳定剂；防止老年人视黄斑退化；抗癌作 用；对心脑血管疾病有防治作用．随着科技的进一 步发展小球藻作为新的叶黄素来源必然越来越受 到人们的普遍重视． 小球藻细胞除了可以利用光能和二氧化碳进行 正常的自养生长外某些特殊的小球藻种还可以在 异养无光照培养条件下利用有机碳源进行生长和繁 殖［7－8］．异养培养小球藻可以克服光照自养培养藻 生物量低等诸多缺陷是提高小球藻产量与产率的 有效途径．Kyle 等［9］ 筛选到一株 Crypthecoainium 藻其异养培养60～90h 后藻细胞干质量浓度可达 40g·L －1 ；另外筛选到的一株菱形藻 （ Nitzschia） ［10］异养培养64h 生物量可达45～48g·L －1．闫 海等［11］在国内成功筛选出能够异养生长的小球藻 种 USTB01异养批量培养96h 藻细胞干质量浓度 可以达到30g·L －1左右．目前我国微藻高密度异 养培养研究还处在萌芽阶段［11－12］未见有能够达到 如此超高细胞浓度藻类培养的研究与产业化报道 美国、日本和以色列等国家已实现小球藻的产业化 生产年产量约为1500～2000t而国际市场的年需 求量约为8000～10000t．笔者在国内率先筛选出 了能够异养生长小球藻种并研究了光照条件下不同 氮源形态和植物激素对其生长的影响［11－13］本文主 要对小球藻在不同培养条件下细胞中叶黄素含量的 变化进行了研究旨在为充分利用小球藻生产叶黄 素等重要生命活性物质提供科学依据和技术储备． 1 实验材料与研究方法 1∙1 实验材料 实验用小球藻藻种是从天然水体中筛选出的小 球藻纯种［11］．实验用含碳化合物包括碳酸氢钠、葡 萄糖、乙酸钠和乙醇．含氮化合物包括硝酸钾、氯化 铵、尿素．所用试剂均为分析纯．实验用叶黄素标 准品购自北京禹光生物科学研究中心． 1∙2 培养基和培养条件 小球藻所用的基础培养基见文献［11］．在不同 碳源形态实验中分别以碳酸氢钠、葡萄糖、乙酸钠 和乙醇作为唯一碳源．在不同氮源实验中分别以 硝酸钾、氯化铵和尿素作为唯一氮源．在不同碳氮 质量比实验中碳氮源分别选择葡萄糖和硝酸钾初 始硝酸钾质量浓度为2g·L －1通过改变葡萄糖添加 量使碳氮质量比分别为15∶120∶125∶130∶1．培 养基初始 pH 值都调至 6∙5 左右．实验器皿为 300mL三角瓶培养量为100mL．培养基和实验器 皿均经121℃的高温和超净工作台紫外灯照射 第29卷 第8期 2007年 8月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29No．8 Aug．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．08．003
第8期 王素琴等：小球藻USTB01的异养培养和叶黄素的生产 .767. 20min灭菌后使用，在洁净工作台内接种小球藻后， 合作用和生长，因此黑暗异养培养小球藻尤其是在 在光照培养箱或振荡恒温培养箱中进行培养，光照 高细胞初始浓度下显示出了非常大的优势和潜力· 培养条件是：30℃，2h光照黑暗循环，光照度 25 3000x,每天摇瓶2次；黑暗培养条件是：30℃，摇 ■一限暗 床转速为200rmin-1. 光照 1.3小球藻生物量的测定 10 用分光光度计在波长680nm下测定光密度 (D680)以示小球藻的生长量，按照如下公式可计算 出对应的小球藻细胞干质量浓度： 时间/d y=0.3571x-0.0027, 图1不同培养方式对小球藻生长的影响 式中，x为D6s0y为藻细胞干质量浓度，gL-1山. Fig.1 Effect of culture condition on the growth of Chlorella sp 1.4叶黄素的提取及检测 在小球藻培养结束时，取5mL藻液，离心 2.2小球藻细胞提取液中叶黄素的识别 (10000rmin-1,10min)后倒去上清液，沉降于离 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液的HPLC 心管底部的藻细胞用磷酸盐缓冲溶液(H=7.0)重 谱图（图2）显示，标准品叶黄素出峰的保留时间为 新悬浮后再次离心倒去上清液，如此重复三次清洗 3.06min,小球藻细胞提取液在同样的保留时间也 藻细胞后，加入5mL甲醇二氯甲烷（体积比2：1） 存在一个明显的出峰（图2(a)),因此初步确认筛选 溶液，用超声波细胞破碎机破碎藻细胞20min(超声 的小球藻种能够产生叶黄素，为了更进一步确认在 10s,间隔2s)后，再次经过离心(10000rmin1, 藻细胞提取液中与标准品叶黄素有着同样保留时间 l0min)取上清液在HPLC上测定.实验前用甲醇 的出峰就是叶黄素，分别对叶黄素标准品的出峰以 二氯甲烷（体积比2：1）配制叶黄素质量浓度分别为 及在藻提取液中与之有相同保留时间的出峰从 4,8,12,16,20mgL的标准溶液，依次在HPLC 375nm到800nm进行吸收扫描.结果显示，标准品 上进行测定，得到叶黄素峰高(y1)与叶黄素质量浓 叶黄素与藻细胞提取液中的出峰的光谱图基本相同 度(x1)的一元线性回归方程(y1=4.0408x1一 (图2(b),最大吸收波长均为447nm左右，因此证 0.8169,决定系数r2=0.9987).实验通过叶黄素 实小球藻中确实含有叶黄素， 峰高计算出对应的叶黄素浓度.叶黄素含量测定条 件是：高效液相色谱(HPLC)仪（岛津LC一1 OATvp 150 ⊙ 泵，SPD一M10AVP二极管阵列检测器)，Zorbax SB一 :标准品 出峰 C18(4.6mm×25cm)分离柱，流动相是乙腈- 100 甲醇-乙酸乙酯（体积比45：10：45），流速为1 小球藻提取 mL'min-1,进样量20L,检测波长为460nm. 物出峰 2结果与讨论 4 6 8 10 2.1小球藻光照与黑暗培养比较 保阐时间/min 500A 图1为不同接种量下，光照与黑暗培养小球藻 6 400 生长的比较.从图中可以看出，当接种量较低时（初 相似系数0.999906 始D8为0.1)，无论是光照还是黑暗培养，小球藻 300 实线一叶黄素标准品 虚线一小球藻提取物 生长都非常缓慢，延迟期达到3d以上，当增大初始 200 藻生物量（初始D680为1.5）后，在黑暗培养条件下， 100 小球藻迅速进入对数生长期，几乎没有延迟期，第2 400450500550600650700750800 天就达到了最大生物量，这与文献[14]得到的结果 波长mm 基本相同，在高初始藻生物量培养条件下，黑暗异 图2叶黄素标准品及小球藻细胞提取液谱图.()HPLC图谱： 养培养小球藻的生长速度远远高于光照培养；其原 (b)扫描图谱 因主要是因为在光照条件下，随着藻细胞浓度的增 Fig.2 Standard lutein and cell-free extract of Chlorella sp:(a) 加，细胞之间会发生相互遮掩现象，影响了藻类的光 HPLC profile;(b)scan profile
20min灭菌后使用．在洁净工作台内接种小球藻后 在光照培养箱或振荡恒温培养箱中进行培养光照 培养条件是：30℃2h 光照黑 暗 循 环光 照 度 3000lx每天摇瓶2次；黑暗培养条件是：30℃摇 床转速为200r·min －1． 1∙3 小球藻生物量的测定 用分光光度计在波长680nm 下测定光密度 （ D680）以示小球藻的生长量．按照如下公式可计算 出对应的小球藻细胞干质量浓度： y＝0∙3571x－0∙0027 式中x 为 D680；y 为藻细胞干质量浓度g·L －1［11］． 1∙4 叶黄素的提取及检测 在小球藻培养结束时取 5mL 藻液离心 （10000r·min －110min）后倒去上清液沉降于离 心管底部的藻细胞用磷酸盐缓冲溶液（pH＝7∙0）重 新悬浮后再次离心倒去上清液如此重复三次清洗 藻细胞后加入5mL 甲醇－二氯甲烷（体积比2∶1） 溶液用超声波细胞破碎机破碎藻细胞20min（超声 10s间隔2s）后再次经过离心（10000r·min －1 10min）取上清液在 HPLC 上测定．实验前用甲醇－ 二氯甲烷（体积比2∶1）配制叶黄素质量浓度分别为 48121620mg·L －1的标准溶液依次在 HPLC 上进行测定得到叶黄素峰高（ y1）与叶黄素质量浓 度（ x1） 的一元线性回归方程（ y1＝4∙0408x1－ 0∙8169决定系数 r 2＝0∙9987）．实验通过叶黄素 峰高计算出对应的叶黄素浓度．叶黄素含量测定条 件是：高效液相色谱（HPLC）仪（岛津 LC－10ATvp 泵SPD－M10Avp 二极管阵列检测器）Zorbax SB－ C18（●4∙6mm ×25cm） 分离柱流动相是乙 腈－ 甲醇－乙酸乙酯 （体 积 比 45∶10∶45）流 速 为 1 mL·min －1进样量20μL检测波长为460nm． 2 结果与讨论 2∙1 小球藻光照与黑暗培养比较 图1为不同接种量下光照与黑暗培养小球藻 生长的比较．从图中可以看出当接种量较低时（初 始 D680为0∙1）无论是光照还是黑暗培养小球藻 生长都非常缓慢延迟期达到3d 以上．当增大初始 藻生物量（初始 D680为1∙5）后在黑暗培养条件下 小球藻迅速进入对数生长期几乎没有延迟期第2 天就达到了最大生物量这与文献［14］得到的结果 基本相同．在高初始藻生物量培养条件下黑暗异 养培养小球藻的生长速度远远高于光照培养；其原 因主要是因为在光照条件下随着藻细胞浓度的增 加细胞之间会发生相互遮掩现象影响了藻类的光 合作用和生长因此黑暗异养培养小球藻尤其是在 高细胞初始浓度下显示出了非常大的优势和潜力． 图1 不同培养方式对小球藻生长的影响 Fig．1 Effect of culture condition on the growth of Chlorella sp 2∙2 小球藻细胞提取液中叶黄素的识别 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液的 HPLC 谱图（图2）显示标准品叶黄素出峰的保留时间为 3∙06min小球藻细胞提取液在同样的保留时间也 存在一个明显的出峰（图2（a））因此初步确认筛选 的小球藻种能够产生叶黄素．为了更进一步确认在 藻细胞提取液中与标准品叶黄素有着同样保留时间 的出峰就是叶黄素分别对叶黄素标准品的出峰以 及在藻提取液中与之有相同保留时间的出峰从 375nm到800nm 进行吸收扫描．结果显示标准品 叶黄素与藻细胞提取液中的出峰的光谱图基本相同 （图2（b））最大吸收波长均为447nm 左右因此证 实小球藻中确实含有叶黄素． 图2 叶黄素标准品及小球藻细胞提取液谱图．（a） HPLC 图谱； （b） 扫描图谱 Fig．2 Standard lutein and cel-l free extract of Chlorella sp： （a） HPLC profile；（b） scan profile 第8期 王素琴等： 小球藻 USTB01的异养培养和叶黄素的生产 ·767·
.768 北京科技大学学报 第29卷 2.3不同碳源对异养培养小球藻生长的影响 持小球藻快速稳定生长，而且也有利于小球藻细胞 在以硝酸钾为氨源且总氮初始质量浓度为 中叶黄素的生物合成 0.28gL和总碳初始质量浓度为4.0gL条件 18P ◆一硝酸钾 下，图3显示以葡萄糖作为碳源时，小球藻可以持续 快速生长，且在培养第2天，小球藻生物量已经达到 2 一尿素 ★一氯化伎 最大(D80为15.60)：在以乙酸钠为碳源时，随着乙 出6 酸盐的利用，培养基pH很快上升到抑制小球藻生 长的程度(9.0以上)，因此小球藻生长缓慢，培养3d 后，小球藻基本不再生长，最大D80达到8.35，仅为 时间d 以葡萄糖为碳源时的53.5%；以碳酸氢钠和乙醇为 图4氨源对小球藻生长的影响 碳源时，小球藻生长呈现停滞状态，可见这两种碳源 Fig-4 Effect of nitrogen source on the growth of Chlorella sp 无法支持小球藻的异养生长，上述结果表明，葡萄 糖是支持小球藻快速稳定生长的最好碳源，这与文 0.70 献[15]得到的结果一致 0.66 0.64 18 0.62 ◆一碳酸氢钠 0.60 一葡萄糖 0.58 12 ★一乙醇 0.56 ·一乙酸钠 硝酸钾 尿素 氯化铵 6 氮源 图5不同氮源条件下小球藻叶黄素产量 时间d Fig.5 Effect of nitrogen source on the content of lutein in the cell of Chlorella sp 图3碳源对小球藻生长的影响 Fig.3 Effect of carbon source on the growth of Chlorella sp 2.5不同碳氮质量比对黑暗异养培养小球藻生长 及叶黄素含量的影响 2.4不同氮源对异养培养小球藻生长及叶黄素含 在氮初始质量浓度都为0.28gL条件下，分 量的影响 别添加不同初始浓度的葡萄糖，使碳氨质量比分别 在葡萄糖初始质量浓度为10gL,总氨初始 为15：1,20：1,25：1和30：1.图6表明，培养第1 质量浓度都为0.28gL条件下，研究了硝酸钾、尿 天，小球藻的生长随碳氨质量比的升高而降低，这说 素和氯化铵对小球藻生长的影响.图4显示，在所 明较高初始浓度的葡萄糖会抑制小球藻的生长，当 用的三种氨源中，小球藻均能生长，但在不同氮源条 碳氨质量比为15：1时，培养第2天后小球藻基本停 件下，生长状况有较大的差别，以氯化铵作为氨源 止生长，说明葡萄糖的不足是限制小球藻持续生长 时，培养第1天小球藻生长良好，但此后小球藻生长 的主要原因，在初始碳氨质量比为25：1时，从培养 基本处于停顿状态；这主要是因为随着氯化铵被利 第3天开始小球藻的生长达到最高，当碳氨质量比 用，培养基pH迅速降低至3.0以下，抑制了小球藻 再增加到30：1时，小球藻最终生长量并没有更进一 的进一步生长·当以硝酸钾作为唯一氨源时，小球 步提高，因此碳氨质量比为25：1时是一个培养小球 藻的生长一直保持最好，最高D680达到了16.4，当 必 以尿素作为唯一氨源时，培养第2天小球藻进入指 30 碳氮质量比 ◆一15 数生长期，最高D680也达到了13.0的较高水平.上 25 ◆-20 20 ★25 述结果表明，与尿素和氯化铵相比，硝酸钾是支持小 量-30 球藻快速稳定生长的最好氮源， 10 图5显示：分别以硝酸钾、尿素和氯化铵作为唯 一氨源时，小球藻都可以产生叶黄素；但当以硝酸钾 0 作为唯一氮源时，小球藻的叶黄素产量最高，达到 时间/d 0.69mgg1;而以尿素或氯化铵作为唯一氨源时， 图6碳氨质量比对小球藻生长的影响 叶黄素含量比以硝酸钾作为氨源时分别下降了 Fig.6 Effect of carbonto-nitrogen mass ratio on the growth of 3.0%和11.8%，这进一步说明硝酸钾不仅可以支 Chlorella sp
2∙3 不同碳源对异养培养小球藻生长的影响 在以硝酸钾为氮源且总氮初始质量浓度为 0∙28g·L －1和总碳初始质量浓度为4∙0g·L －1条件 下图3显示以葡萄糖作为碳源时小球藻可以持续 快速生长且在培养第2天小球藻生物量已经达到 最大（ D680为15∙60）；在以乙酸钠为碳源时随着乙 酸盐的利用培养基 pH 很快上升到抑制小球藻生 长的程度（9∙0以上）因此小球藻生长缓慢培养3d 后小球藻基本不再生长最大 D680达到8∙35仅为 以葡萄糖为碳源时的53∙5％；以碳酸氢钠和乙醇为 碳源时小球藻生长呈现停滞状态可见这两种碳源 无法支持小球藻的异养生长．上述结果表明葡萄 糖是支持小球藻快速稳定生长的最好碳源这与文 献［15］得到的结果一致． 图3 碳源对小球藻生长的影响 Fig．3 Effect of carbon source on the growth of Chlorella sp 2∙4 不同氮源对异养培养小球藻生长及叶黄素含 量的影响 在葡萄糖初始质量浓度为10g·L －1总氮初始 质量浓度都为0∙28g·L －1条件下研究了硝酸钾、尿 素和氯化铵对小球藻生长的影响．图4显示在所 用的三种氮源中小球藻均能生长但在不同氮源条 件下生长状况有较大的差别．以氯化铵作为氮源 时培养第1天小球藻生长良好但此后小球藻生长 基本处于停顿状态；这主要是因为随着氯化铵被利 用培养基 pH 迅速降低至3∙0以下抑制了小球藻 的进一步生长．当以硝酸钾作为唯一氮源时小球 藻的生长一直保持最好最高 D680达到了16∙4．当 以尿素作为唯一氮源时培养第2天小球藻进入指 数生长期最高 D680也达到了13∙0的较高水平．上 述结果表明与尿素和氯化铵相比硝酸钾是支持小 球藻快速稳定生长的最好氮源． 图5显示：分别以硝酸钾、尿素和氯化铵作为唯 一氮源时小球藻都可以产生叶黄素；但当以硝酸钾 作为唯一氮源时小球藻的叶黄素产量最高达到 0∙69mg·g －1 ；而以尿素或氯化铵作为唯一氮源时 叶黄素含量比以硝酸钾作为氮源时分别下降了 3∙0％和11∙8％这进一步说明硝酸钾不仅可以支 持小球藻快速稳定生长而且也有利于小球藻细胞 中叶黄素的生物合成． 图4 氮源对小球藻生长的影响 Fig．4Effect of nitrogen source on the growth of Chlorella sp 图5 不同氮源条件下小球藻叶黄素产量 Fig．5 Effect of nitrogen source on the content of lutein in the cell of Chlorella sp 2∙5 不同碳氮质量比对黑暗异养培养小球藻生长 及叶黄素含量的影响 图6 碳氮质量比对小球藻生长的影响 Fig．6 Effect of carbon-to-nitrogen mass ratio on the growth of Chlorella sp 在氮初始质量浓度都为0∙28g·L －1条件下分 别添加不同初始浓度的葡萄糖使碳氮质量比分别 为15∶120∶125∶1和30∶1．图6表明培养第1 天小球藻的生长随碳氮质量比的升高而降低这说 明较高初始浓度的葡萄糖会抑制小球藻的生长．当 碳氮质量比为15∶1时培养第2天后小球藻基本停 止生长说明葡萄糖的不足是限制小球藻持续生长 的主要原因．在初始碳氮质量比为25∶1时从培养 第3天开始小球藻的生长达到最高．当碳氮质量比 再增加到30∶1时小球藻最终生长量并没有更进一 步提高因此碳氮质量比为25∶1时是一个培养小球 ·768· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
第8期 王素琴等：小球藻USTB01的异养培养和叶黄素的生产 .769 藻的优化控制条件. 成叶黄素的最好氮源， Shi等16]报道，在小球藻异养培养过程中，当葡 (4)采用葡萄糖和硝酸钾作为碳氮源，其碳氨 萄糖初始质量浓度大于80gL时才会对小球藻的 质量比为25：1时是获得最大藻生物量和叶黄素产 生长产生抑制：但笔者得到的结果表明，初始葡萄糖 量的优化控制条件. 质量浓度大于17.3gL1时就会对小球藻的生长有 所影响山]，因此在发酵罐培养小球藻的过程中，应 参考文献 实行流加控制，以避免高葡萄糖浓度的抑制效应， [1】陈峰，姜悦.微藻生物技术.北京：中国轻工业出版社，1999： 55 刘世名等12]报道，流加分批培养小球藻时，补料液 [2]Haskin HH.A spectrophotometric method for analysis of chloro 中最适碳氨质量比为41.2；但笔者的实验结果表 plast pigment.J Biol Chem.1942.114:149 明，碳氨质量比为25：1时对促进小球藻的异养生长 [3]Shearon W H.Carotene and cancer in animal models.J Nutr. 比较合适，这可能是由于所采用的藻种不同所致， 1989,119,123 图7是不同碳氨质量比培养条件下小球藻细胞 [4]Philip.Purification of lutein fatty acid esters from plant materials: 中叶黄素含量的变化·从图中可以看出，随着碳氮 US patent,4048203.1977-09-13 [5]Khacik.Process for isolation.purification,and recrystallization of 质量比的增加，小球藻细胞中叶黄素含量逐渐降低； lutein from saponified marigold oleoresin and uses thereof:US 但因为藻生物量增加，使叶黄素总量呈现先上升后 patent,5382714.1995-0-17 下降的趋势，当碳氨质量比为25：1时叶黄素总量最 [6]Madhavi.Process for the isolation of mixed carotenoids from 大，达到了4.7mgL1.由此进一步说明，碳氨质 plants:US patent,6380442.2002-04-30 量比25：1是获得最大叶黄素生产量的较为合适的 [7]Endo H.Sansawa H.Nakajima K.Studies on Chlorella regu laris.Mixtrophic growth in relation to light intensity and ac 碳氮质量比 etate concentration.Plant Cell Phys.1977,19:199 0.7 [8]Ikuko.Ishikawa S.Nutritional control of cell pigmentation in 60 4 Chlorella photothecides with special reference to the degeneration 0.6 of chloroplast induced by glucose.Plant Cell Phys.1964.5:227 0.5 3 [9]Kyle D.Production and use of lipids from microalgae.Lipid Technol,1992.4(3):59 0.4 2 [10]Borowitzka M A.Microalgae source of pharmaceuticals and other 0. 古 15 20 25 30 biologically active compounds.J Appl Phycol.1995.7:3 碳氨质量比 [11]闫海，周洁，何宏胜，等.小球藻的筛选和异养培养.北京科 技大学学报，2005,27(4)：408 图7碳氨质量比对小球藻细胞中叶黄素含量的影响 [12]刘世名，孟海华，梁世中，等。生物反应器高密度异养培养 Fig-7 Effect of carbon-to-nitrogen ratio on the content of lutein in 小球藻，华南理工大学学报：自然科学版，2000,28(2)：81 the cell of Chlorella sp [13]王素琴，闫海，张宾.不同氮源形态和植物激素对小球藻 USTB01生长及叶黄素含量的效应.科技导报，2005,12：37 3 结论 [14]Liu S M.Chen F,Liang S Z.Researches on the heterotrophic culture of Chlorella vulgaris"optimization of carbon sources,ni- (1)与光照培养相比，黑暗异养培养小球藻不 trogen sources,inoculum size and initial pH.J South China Univ 仅可以获得更高的藻生物量，也可以获得很大的叶 Technol,1999(4):111 [15]余若黔，刘学铭，梁世中，等.小球藻的异养生长特性研究 黄素生产量，具有非常重要的应用前景和潜力 海洋通报，2000,6：57 (2)与碳酸氢钠、乙醇和乙酸钠相比，葡萄糖是 [16]Shi X M.Liu H J.Zhang X W.et al.Production of biomass 支持小球藻持续快速异养生长的最好碳源， and lutein by Chlorella protothecoides at various glucose concen- (3)与尿素和氯化铵相比，硝酸钾不仅可以支 trations in heterotrophic cultures.Process Biochem.1999,34 持小球藻异养快速生长，而且是促进小球藻生物合 (4):341
藻的优化控制条件． Shi 等［16］报道在小球藻异养培养过程中当葡 萄糖初始质量浓度大于80g·L －1时才会对小球藻的 生长产生抑制；但笔者得到的结果表明初始葡萄糖 质量浓度大于17∙3g·L －1时就会对小球藻的生长有 所影响［11］．因此在发酵罐培养小球藻的过程中应 实行流加控制以避免高葡萄糖浓度的抑制效应． 刘世名等［12］报道流加分批培养小球藻时补料液 中最适碳氮质量比为41∙2；但笔者的实验结果表 明碳氮质量比为25∶1时对促进小球藻的异养生长 比较合适这可能是由于所采用的藻种不同所致． 图7是不同碳氮质量比培养条件下小球藻细胞 中叶黄素含量的变化．从图中可以看出随着碳氮 质量比的增加小球藻细胞中叶黄素含量逐渐降低； 但因为藻生物量增加使叶黄素总量呈现先上升后 下降的趋势当碳氮质量比为25∶1时叶黄素总量最 大达到了4∙7mg·L －1．由此进一步说明碳氮质 量比25∶1是获得最大叶黄素生产量的较为合适的 碳氮质量比． 图7 碳氮质量比对小球藻细胞中叶黄素含量的影响 Fig．7 Effect of carbon-to-nitrogen ratio on the content of lutein in the cell of Chlorella sp 3 结论 （1） 与光照培养相比黑暗异养培养小球藻不 仅可以获得更高的藻生物量也可以获得很大的叶 黄素生产量具有非常重要的应用前景和潜力． （2） 与碳酸氢钠、乙醇和乙酸钠相比葡萄糖是 支持小球藻持续快速异养生长的最好碳源． （3） 与尿素和氯化铵相比硝酸钾不仅可以支 持小球藻异养快速生长而且是促进小球藻生物合 成叶黄素的最好氮源． （4） 采用葡萄糖和硝酸钾作为碳氮源其碳氮 质量比为25：1时是获得最大藻生物量和叶黄素产 量的优化控制条件． 参 考 文 献 ［1］ 陈峰姜悦．微藻生物技术．北京：中国轻工业出版社1999： 55 ［2］ Haskin H H．A spectrophotometric method for analysis of chloroplast pigment．J Biol Chem1942114：149 ［3］ Shearon W H．Carotene and cancer in animal models．J Nutr 1989119：123 ［4］ Philip．Purification of lutein-fatty acid esters from plant materials： US patent4048203．1977－09－13 ［5］ Khacik．Process for isolationpurificationand recrystallization of lutein from saponified marigold oleoresin and uses thereof：US patent5382714．1995－01－17 ［6］ Madhavi．Process for the isolation of mixed carotenoids from plants：US patent6380442．2002－04－30 ［7］ Endo HSansawa HNakajima K．Studies on Chlorella regularis．Ⅲ．Mixtrophic growth in relation to light intensity and acetate concentration．Plant Cell Phys197719：199 ［8］ IkukoIshikawa S．Nutritional control of cell pigmentation in Chlorella photothecoides with special reference to the degeneration of chloroplast induced by glucose．Plant Cell Phys19645：227 ［9］ Kyle D．Production and use of lipids from microalgae．Lipid Technol19924（3）：59 ［10］ Borowitzka M A．Microalgae source of pharmaceuticals and other biologically active compounds．J Appl Phycol19957：3 ［11］ 闫海周洁何宏胜等．小球藻的筛选和异养培养．北京科 技大学学报200527（4）：408 ［12］ 刘世名孟海华梁世中等．生物反应器高密度异养培养 小球藻．华南理工大学学报：自然科学版200028（2）：81 ［13］ 王素琴闫海张宾．不同氮源形态和植物激素对小球藻 USTB01生长及叶黄素含量的效应．科技导报200512：37 ［14］ Liu S MChen FLiang S Z．Researches on the heterotrophic culture of Chlorella v ulgaris-optimization of carbon sourcesnitrogen sourcesinoculum size and initial pH．J South China Univ Technol1999（4）：111 ［15］ 余若黔刘学铭梁世中等．小球藻的异养生长特性研究． 海洋通报20006：57 ［16］ Shi X MLiu H JZhang X Wet al．Production of biomass and lutein by Chlorella p rotothecoides at various glucose concentrations in heterotrophic cultures．Process Biochem199934 （4）：341 第8期 王素琴等： 小球藻 USTB01的异养培养和叶黄素的生产 ·769·
.770. 北京科技大学学报 第29卷 Heterotrophic culture of Chlorella sp USTBOl and production of lutein WANG Suqin2),LI Yawen),YAN Hai,YANG Shuai2),LIN Hai?) 1)Applied Science School.University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083.China 2)Civil and Environmental Engineering School,University of Science and Technology Beijing.Beijing 100083,China 3)Department of Biological Technology,Beijing University of Aeronautics and Astronautics.Beijing 100083.China ABSTRACI The effects of carbon and nitrogen sources as well as carbon to-nitrogen mass ratio on the growth of Chlorella sp USTBOl and the production of lutein were investigated under the condition of heterotrophic cul- ture in dark.The results show that glucose and potassium nitrate were the best carbon and nitrogen sources to support the rapid and continuous growth of Chlorella sp USTBO1 respectively.When glucose and potassium ni- trate were used as the sole carbon and nitrogen sources and the initial concentration of nitrogen was.8g the growth of Chlorella sp increased with the increase of carbon to-nitrogen mass ratio in the range from 15 to 25.Potassium nitrate was the best nitrogen source to promote biosynthesis of lutein by Chlorella sp USTBO1 and the content of lutein in the cells of Chlorella sp USTBO1 declined with the increase of carbon-nitrogen mass ratio from 15 to 30. KEY WORDS Chlorella sp:heterotrophic culture;lutein;carbon source;nitrogen source;carbon to nitrogen ratio (上接第758页) Influence factors of mine gas hydrate formation in surfactant solution containing coal WU Qiang,ZHA NG Baoyong Safety Engineering Technology School,Heilongjiang Institute of Science Technology.Harbin 150027,China ABSTRACI In order to promote mine gas hydrate formation quickly,which can prevent coal and gas outburst, the processes of gas hydrate formation in three reaction systems containing coal were investigated by utilizing the visible experimental installation under the condition of 14.3-25.4C and 18.66-26.70 MPa,and the correla- tions among pressure,temperature and time were obtained.Experimental data were analyzed based on the com- putation models of formation rate and volumetric proportion.The results show that the addition of surfactant shortens induction time and improves formation rate and volumetric proportion,and the volumetric proportion of synthetic hydrate samples can amount to 136-150;the existence of porous medium (coal)delays hydrate for- mation exiguously;the influence of memory effect on gas hydrate formation is notable,the induction time could be shortened by 10-20 times for the experimental system containing residual pentahedral ring structure. KEY WORDS mine gas:hydrate;surfactant;formation rate;memory effect;influence factor
Heterotrophic culture of Chlorella sp USTB01and production of lutein WA NG Suqin 12）LI Y awen 3）Y A N Hai 1）Y A NG Shuai 2）LIN Hai 2） 1） Applied Science SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China 2） Civil and Environmental Engineering SchoolUniversity of Science and Technology BeijingBeijing100083China 3） Department of Biological TechnologyBeijing University of Aeronautics and AstronauticsBeijing100083China ABSTRACT The effects of carbon and nitrogen sources as well as carbon-to-nitrogen mass ratio on the growth of Chlorella sp USTB01and the production of lutein were investigated under the condition of heterotrophic culture in dark．The results show that glucose and potassium nitrate were the best carbon and nitrogen sources to support the rapid and continuous growth of Chlorella sp USTB01respectively．When glucose and potassium nitrate were used as the sole carbon and nitrogen sources and the initial concentration of nitrogen was0∙28g·L －1 the growth of Chlorella sp increased with the increase of carbon-to-nitrogen mass ratio in the range from 15to 25．Potassium nitrate was the best nitrogen source to promote biosynthesis of lutein by Chlorella sp USTB01 and the content of lutein in the cells of Chlorella sp USTB01declined with the increase of carbon-nitrogen mass ratio from15to30． KEY WORDS Chlorella sp；heterotrophic culture；lutein；carbon source；nitrogen source；carbon-to-nitrogen ratio （上接第758页） Influence factors of mine gas hydrate formation in surfactant solution containing coal W U QiangZHA NG Baoyong Safety Engineering ＆ Technology SchoolHeilongjiang Institute of Science ＆ TechnologyHarbin150027China ABSTRACT In order to promote mine gas hydrate formation quicklywhich can prevent coal and gas outburst the processes of gas hydrate formation in three reaction systems containing coal were investigated by utilizing the visible experimental installation under the condition of14∙3－25∙4℃ and18∙66－26∙70MPaand the correlations among pressuretemperature and time were obtained．Experimental data were analyzed based on the computation models of formation rate and volumetric proportion．The results show that the addition of surfactant shortens induction time and improves formation rate and volumetric proportionand the volumetric proportion of synthetic hydrate samples can amount to136－150；the existence of porous medium （coal） delays hydrate formation exiguously；the influence of memory effect on gas hydrate formation is notablethe induction time could be shortened by 10－20times for the experimental system containing residual pentahedral ring structure． KEY WORDS mine gas；hydrate；surfactant；formation rate；memory effect；influence factor ·770· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
