集器,分管收集流出液。以蒸馏水为对照,测定各管在260nm波长下的A26值,,给各 管编号,并标出最高峰的收集管 7.核苷酸的鉴定 分别测定最高峰管内液体在230nm~300mm之间,每相差5rm间隔的光吸收值。 其中包括有250、260、280,290mm各点(注意:液体均要保留,切勿倒掉。测量时用 石英杯)。由于在小于250nm时,甲酸( HCOOH)具有很强的光吸收值,因此测定 时所用参比对照液近似为 第一个峰用0.05M甲酸—0.05M甲酸钠 第二个峰用0.10M甲酸一0.10M甲酸钠 第三个峰用015M甲酸一0.15M甲酸钠 第四,五两峰用0.20M甲酸-0.20M甲酸钠 也可以根据最高峰所在位置,计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液 8.测定各种核苷酸的含量和总回收率: 分别合并(包括最高峰管在内)各组份洗脱峰管内的洗脱液,用量筒测出溶液总体 积,然后测定其A26值,参比对照液同上。根据层析柱上样液的A260值以及层析后所 得到的各组份A260值之和,可以计算出离子交换柱层析的回收率。(注:RNA的摩尔消 光系数E6m为7.7~7.8×103,水解后增值40%)。 9树脂的再生: 使用过的离子交换树脂经过再生处理后,可重复使用。可以在柱内处理,也可以将 树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气,用烧杯收集 流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗涤,最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。 五、结果处理 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线,以层析流出液管数(或体积) 为横座标,以相应的A260值为纵座标,作出洗脱曲线图 2.作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图,根据各组份溶液在230-300nm波长范围内 的吸光度值,以波长(nm)为横座标,吸光度值为纵座标,作出它们的吸收光谱图。由 图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值λmax,同时,计算出各个组份在不 同波长的吸光度值比值(250/260,280260,290/260),将它们与各核苷酸的标准值(见 表2,取pH=2和pH=7两组值的平均值为标准值)列表比较,从而鉴定出各组份为何220 集器，分管收集流出液。以蒸馏水为对照，测定各管在 260nm 波长下的 A260 值，，给各 管编号，并标出最高峰的收集管。 7. 核苷酸的鉴定： 分别测定最高峰管内液体在 230nm ~ 300nm 之间，每相差 5nm 间隔的光吸收值。 其中包括有 250、260、280，290nm 各点（注意：液体均要保留，切勿倒掉。测量时用 石英杯）。由于在小于 250nm 时，甲酸（ HCOOH ）具有很强的光吸收值，因此测定 时所用参比对照液近似为： 第一个峰用 0.05M 甲酸—0.05M 甲酸钠 第二个峰用 0.10M 甲酸—0.10M 甲酸钠 第三个峰用 0.15M 甲酸—0.15M 甲酸钠 第四，五两峰用 0.20M 甲酸⎯ 0.20M 甲酸钠 也可以根据最高峰所在位置，计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液。 8. 测定各种核苷酸的含量和总回收率： 分别合并（包括最高峰管在内）各组份洗脱峰管内的洗脱液，用量筒测出溶液总体 积，然后测定其 A260 值，参比对照液同上。根据层析柱上样液的 A260 值以及层析后所 得到的各组份 A260 值之和，可以计算出离子交换柱层析的回收率。（注：RNA 的摩尔消 光系数 E260nm 为 7.7 ~ 7.8×10³，水解后增值 40 % )。 9. 树脂的再生： 使用过的离子交换树脂经过再生处理后，可重复使用。可以在柱内处理，也可以将 树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气，用烧杯收集 流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用 1M NaCl 溶液浸泡或洗涤，最后用蒸馏水洗至流出液的 pH 值接近中性。 五、结果处理 1. 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线，以层析流出液管数（或体积） 为横座标，以相应的 A260 值为纵座标，作出洗脱曲线图。 2. 作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图，根据各组份溶液在 230~300nm 波长范围内 的吸光度值，以波长（nm）为横座标，吸光度值为纵座标，作出它们的吸收光谱图。由 图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值 max ，同时，计算出各个组份在不 同波长的吸光度值比值（250/260，280/260，290/260），将它们与各核苷酸的标准值（见 表 2，取 pH=2 和 pH=7 两组值的平均值为标准值）列表比较，从而鉴定出各组份为何