2252海南医学院学报Vol22Na19Oct2016 ing of malignant group, the lower the p21, p53 and PtEN expression levels in tumor tissue and they were negatively correlated with DNMTI and HDACI levels in serum, and the higher the c-myc and MKi67 expression levels and they were positively correlated with DNMTI and HDACI levels in serum. Conclusions: Serum DNMTI and HDACI levels in patients with NSCLC significantly increase and can lower tumor-suppressor gene expression, promote proto-oncogene expression and participate in he occurrence and development of tumor. [KEY WORDS] Nonr-small cell lung cancer: DNA methyltransferase 1: Histone deacetylases 1: Proto-oncogene: Tumor- 非小细胞肺癌( nonsmall cell lung cancer,康为世纪公司;低温离心机以及多功能酶标仪、洗板机为 NSCLO)是我国发病率最高的恶性肿瘤,手术切除 Thermo公司,荧光定量PCR反应仪为 Biorad公司 以及放化疗、靶向治疗是主要的治疗手段。目前,关1.3血清DNMT、HDAC1含量检测 于 NSCLO发生及发展的调控机制尚未明确。基因 取恶性组和良性组血清标本,采用北京鼎国生物公司的 组DNA甲基化修饰、组蛋白乙酰化修饰是近年来人DNMT1、HDAC1酶联免疫吸附试剂盒进行实验,所有操 新发现的表观遗传学调控机制,能够调节多种原癌 作按试剂盒说明书进行,在酶标仪上读取特定波长处的吸光 值后,参照已知浓度的标准品吸光值计算待测血清样本中 基因、抑癌基因的表达并参与恶性肿瘤的发生和发 DNMT1、HDAC1的含量 展[1:。DNA甲基化转移酶1( DNA methyltrans14肿瘤组织中恶性分子表达量检测 ferase1,DNMT1)是维持体内基因甲基化状态的重 取恶性组肿瘤组织,称量约30mg并加入PBS缓冲液 要催化酶,而组蛋白去乙酰化酶1( histone deacety-300plL,研磨后将研磨液在低温离心机中以1200/min lases1,HDAC1)则是调控组蛋白乙酰化水平的重速度离心20min,弃去沉淀、保留上清并采用酶联免疫吸附 要催化酶。已有研究报道,抑制肺癌A549细胞株试剂盒测定p53、p2l、PTEN、c-mye、MK67的含量,所有操 中的甲基转移酶活性以及去乙酰化酶活性能够激活作按试剂盒说明书进行 p53、p21、PTEN等抑癌基因的表达,进而抑制肺癌 1.5统计学 细胞的生长。但是,关于肺癌患者体内 采用SPSs19.0软件录入和分析数据,计量资料的两组 HDAC1、DNMT1含量与抑癌基因、原癌基因表达间分析采用t检验、3组或4组分析采用方差分析两计量资 的关系尚不明确。本研究分析了 NSCLO患者血清 料间的相关性采用 Pearson检验,按照P<0.05判断差异有 统计学意义。 HDAC1和DNMT1含量与肿瘤临床病理分期、恶 2结果 性分子表达的相关性 2.1良性组和恶性组患者血清DNMT1、HDAC1含量 1材料与方法 恶性组血清中DNMT1和HDAC1含量显著高于对照 1.1临床标本 组(P<0.05)。见表1 选择2012年4月~2015年10月在我院确诊为NSIC 的89例患者,收集肺癌组织及血清标本,包括鱗癌39例、腺 表1良性组和恶性组患者血清中DNMT1和 HDAC1的含量比较(pg/L,x±s) 癌27例、其他23例,TNMI期12例、Ⅱ期36例、Ⅲ期28别例数Mm 例、Ⅳ期13例。所有 NSCLO患者经病理学确诊,采集临床 恶性组89 59.25±8.25 468.76±71.35 标本时均未接受放化疗、免疫治疗、靶向治疗。选择同期 良性组64 16.59±2 242.54±34.61 我院就诊的64例肺良性病变患者,包括肺部感染、支气管哮 <0.05 喘、支气管扩张,治疗前收集血清标本。 NSCLO患者作为恶 5<005 性组,包括男性52例,女性37例,年龄(57.2±8.5)岁;肺部22恶性组不同TNM分期、组织类型患者的血清DN 良性病变患者作为良性组,包括男性39例,女性25例,年龄MT1、HDAC1含量 不同TNM分期 NSCLC患者的血清 DNMTI、HDAC1 (55.8±7.9)岁。两组一般资料比较无显著性差异(P>含量有显著性差异,TNM分期越高、血清 DNMTI、HDAC1 0.05),具有可比性 含量越高,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。恶性 1.2实验材料及仪器 组不同组织类型患者的血清DNMT1、HDAC1含量分析如 酶联免疫吸附试剂盒为北京鼎国生物公司,RNA抽提、下:鱗癌、腺癌以及其他组织类型 NSCLO患者的血清DN cDNA第一链合成以及荧光定量PCR扩增试剂盒均为北京MT1、HDAC1含量无显著性差异(P>0.05)。见表2 21994-2016ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.netｉｎｇｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｏｗｅｒｔｈｅｐ２１，ｐ５３ａｎｄＰＴＥＮｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅａｎｄｔｈｅｙｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈＤＮＭＴ１ａｎｄＨＤＡＣ１ｌｅｖｅｌｓｉｎｓｅｒｕｍ，ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒｔｈｅｃ－ｍｙｃａｎｄ ＭＫｉ－６７ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓａｎｄｔｈｅｙｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＤＮＭＴ１ａｎｄＨＤＡＣ１ｌｅｖｅｌｓｉｎｓｅｒｕｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＳｅｒｕｍＤＮＭＴ１ａｎｄＨＤＡＣ１ｌｅｖｅｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＮＳＣＬＣ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅａｎｄｃａｎｌｏｗｅｒｔｕｍｏｒ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎ ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｕｍｏｒ． ［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ；ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１；Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ１；Ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ；Ｔｕｍｏｒ－ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ 非 小 细 胞 肺 癌 （ｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ， ＮＳＣＬＣ）是我国发病率最高的恶性肿瘤，手 术 切 除 以及放化疗、靶向治疗是主要的治疗手段。目前，关 于 ＮＳＣＬＣ发生及发展的调控机制尚未明确。基因 组 ＤＮＡ 甲基化 修 饰、组蛋白乙酰化修饰是近年来 新发现的表观遗传学调控机制，能够调节多种原癌 基因、抑癌基因的表达并参与恶性肿瘤的发生和发 展［１，２］。ＤＮＡ 甲基 化 转 移 酶 １（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ－ ｆｅｒａｓｅ１，ＤＮＭＴ１）是维持体内基因甲基化状态的重 要催化酶，而组蛋白去乙酰化酶１（ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙ－ ｌａｓｅｓ１，ＨＤＡＣ１）则是调控组蛋白乙酰化水平的重 要催化酶。已 有 研 究 报 道，抑 制 肺 癌 Ａ５４９细 胞 株 中的甲基转移酶活性以及去乙酰化酶活性能够激活 ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ 等抑癌基因的表达，进而抑制肺癌 细 胞 的 生 长［３，４］。 但 是，关 于 肺 癌 患 者 体 内 ＨＤＡＣ１、ＤＮＭＴ１含 量 与 抑 癌 基 因、原 癌 基 因 表 达 的关系尚不明确。本研究分析了 ＮＳＣＬＣ患者血清 ＨＤＡＣ１和 ＤＮＭＴ１含 量 与 肿 瘤 临 床 病 理 分 期、恶 性分子表达的相关性。 １ 材料与方法 １．１ 临床标本 选择２０１２年４月～２０１５年１０月在我院确诊为 ＮＳＣＬＣ 的８９例患者，收集肺癌组织及血清标本，包括鳞癌３９例、腺 癌２７例、其他２３例，ＴＮＭ Ⅰ期１２例、Ⅱ期３６例、Ⅲ期２８ 例、Ⅳ期１３例。所有 ＮＳＣＬＣ患者经病理学确诊，采 集 临 床 标本时均未接受放化疗、免 疫 治 疗、靶 向 治 疗。选 择 同 期 在 我院就诊的６４例肺良性病变患者，包括肺部感染、支气管哮 喘、支气管扩张，治疗前收集血清标本。ＮＳＣＬＣ患者作为恶 性组，包括男性５２例，女性３７例，年龄（５７．２±８．５）岁；肺 部 良性病变患者作为良性组，包括男性３９例，女性２５例，年龄 （５５．８±７．９）岁。两组一般资料比较无显著性差异 （Ｐ ＞ ０．０５），具有可比性。 １．２ 实验材料及仪器 酶联免疫吸附试剂盒为北京鼎国生物公司，ＲＮＡ 抽提、 ｃＤＮＡ 第一链合成以及荧光定量 ＰＣＲ 扩增试剂盒 均 为 北 京 康为世纪 公 司；低温离心机以及多功能酶标仪、洗 板 机 为 Ｔｈｅｒｍｏ公司，荧光定量 ＰＣＲ反应仪为 Ｂｉｏ－ｒａｄ公司。 １．３ 血清 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１含量检测 取恶性组和良性组血清标本，采用北京鼎国生物公司的 人 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１酶联免疫吸附试剂盒进行实验，所有操 作按试剂盒说明书进行，在酶标仪上读取特定波长处的吸光 值后，参照已知浓度的标准品吸光值计算待测血清样本中 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１的含量 １．４ 肿瘤组织中恶性分子表达量检测 取恶性组肿瘤 组 织，称 量 约３０ｍｇ并 加 入 ＰＢＳ缓 冲 液 ３００μＬ，研磨后将研磨液在低温离心机中以１２０００ｒ／ｍｉｎ的 速度离心２０ｍｉｎ，弃去沉淀、保留上清并采用酶联免疫吸附 试剂盒测定ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ｃ－ｍｙｃ、ＭＫｉ－６７的含量，所有操 作按试剂盒说明书进行。 １．５ 统计学处理 采用ＳＰＳＳ１９．０软件录入 和 分 析 数 据，计量资料的两组 间分析采用ｔ检验、３组或４组分析采用方差分析，两计量资 料间的相关性采用 Ｐｅａｒｓｏｎ检验，按照Ｐ＜０．０５判断差异有 统计学意义。 ２ 结果 ２．１ 良性组和恶性组患者血清 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１含量 恶性组血清中 ＤＮＭＴ１和 ＨＤＡＣ１含量显著高于对照 组（Ｐ＜０．０５）。见表１。 表１ 良性组和恶性组患者血清中 ＤＮＭＴ１和 ＨＤＡＣ１的含量比较（μｇ／Ｌ，ｘ珚±ｓ） 组别 例数 ＤＮＭＴ１ ＨＤＡＣ１ 恶性组 ８９ ５９．２５±８．２５ ４６８．７６±７１．３５ 良性组 ６４ １６．５９±２．２６ ２４２．５４±３４．６１ ｔ ２６．９４２ １４．２５１ Ｐ ＜０．０５ ＜０．０５ ２．２ 恶 性 组 不 同 ＴＮＭ 分 期、组织类型患者的血清 ＤＮ－ ＭＴ１、ＨＤＡＣ１含量 不同 ＴＮＭ 分期 ＮＳＣＬＣ患 者 的 血 清 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１ 含量有显著性差异，ＴＮＭ 分 期 越 高、血 清 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１ 含量越高，两两比较差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。恶 性 组不同组织类型患者的血清 ＤＮＭＴ１、ＨＤＡＣ１含 量 分 析 如 下：鳞癌、腺癌以及其他组织类型 ＮＳＣＬＣ 患 者 的 血 清 ＤＮ－ ＭＴ１、ＨＤＡＣ１含量无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。见表２。 ２５２２ 海南医学院学报 Ｖｏｌ．２２Ｎｏ．１９Ｏｃｔ．２０１６