第41卷第6期 2016年6月 州医科大学学报 Vol 41 No 6 JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY 2016.6 人 hnrnA2/ BishRNA慢病毒载体的构建 刘瑶*,石祥,方文… 贵州医科大学临床生化教研室,贵州贵阳550004) [摘要]目的:构建人核内不均一核糖核蛋白A2/B1( hnRNPA2/Bl)基因的短发夹RNA(shNA)慢病毒载 体。方法:根据 hnRNA2/B1基因序列,设计4对 hnRNA2/ BI shRNA的干扰序列和1对阴性对照序列(NC ShRNA);合成靶序列双链DNA,与 PGMLV-SCSRNA慢病毒载体连接,通过测序鉴定阳性克隆;用构建的慢病毒 表达载体和包装质粒共转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察转染病毒72h后细胞中绿色荧光蛋白的表达,以 验证共转染是否成功,超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果:经酶切和 BLAST对测序结果比对,重组克 隆中插入的序列与设计合成的4对 shRNA及1对阴性对照 oligo dna完全一致,提示慢病毒载体构建成功;荧 光显微镜下,HEK293T细胞可见强绿色荧光蛋白表达,慢病毒载体成功共转染入HEK293T细胞,病毒滴度为5 10TU/L。结论:成功构建人 hnRNA2/B1基因 shRNA慢病毒载体,病毒滴度达5×10TU/L 关键词]RNA干扰;慢病毒;293T细胞;载体;短发夹RNA;核内不均一核糖核蛋白基因 [中图分类号]q782[文献标识码]A[文章编号]10002707(2016)06-6305 DoI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.003 Construction and Identification of Lentivirus vector of shrna for human hnrnPa2/Bl Gene LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen Department of Clinical Biochemistry, Guizhou Medcial University, Guiyang 550004, Guizhou, China) Abstract] Objective: To construct lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/Bl gene. Meth ods: According to the sequence of hnRNPA2/Bl gene, 4 pairs of interference sequence containing hnRNPA2/Bl shRNA and 1 pairs of interference sequence containing negative control were designed Targeted double chain DNA was synthesized and connected to the lentivirus vector. Positive clones were identified by sequencing. The constructed vector of slow virus expression vector and packaging plasmids were co-transfected to HEK293T cells. The expression of green fluorescent protein was ob- served under fluorescence microscope 72 h after virus transfection in order to verify whether co-trans- fection was successful or not. Ultrafiltration concentrated virus solution and the virus titer was deter- mined. Results: Comparison of the results of enzyme digestion and blast sequencing showed that the insertion sequence of the recombinant clones was completely consistent with 4 pairs of shRNA and 1 pair negative control DNA oligo, indicating that the Lentivirus vector containing shRNA hnRNPA2/B1 was successfully constructed. Under the fluorescence microscope, the 293T HEK cells showed stror green fluorescent protein expression, indicating that the slow virus vector was successfully co-transfect- ed into 293T HEK cells. The virus titer was 5x10 tU/L. Conclusions, Lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/Bl gene is successfully constructed, and the virus titer is 5 x 10" tU/L Key words RNA interference; lentivirus; 293T cells; vector; Short hairpin RNA; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene [基金项目]国家自然科学基金(81560481) 贵州医科大学2013级硕士研究生 通信作者E-mil:281123997@q.com 网络出版时间:2016-06-16网络出版地址:htp://w.cnki.net/kcms/ detail/52.5012.R.20160616.1648.024.hml人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建 刘 瑶，石 祥，方 文 （贵州医科大学 临床生化教研室，贵州 贵阳 ５５０００４） ［摘 要］目的：构建人核内不均一核糖核蛋白 Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１）基因的短发夹 ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）慢病毒载 体。方法：根据 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因序列，设计 ４对 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ的干扰序列和 １对阴性对照序列（ＮＣ ＳｈＲＮＡ）；合成靶序列双链 ＤＮＡ，与 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，通过测序鉴定阳性克隆；用构建的慢病毒 表达载体和包装质粒共转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，荧光显微镜下观察转染病毒７２ｈ后细胞中绿色荧光蛋白的表达，以 验证共转染是否成功，超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果：经酶切和 ＢＬＡＳＴ对测序结果比对，重组克 隆中插入的序列与设计合成的 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ完全一致，提示慢病毒载体构建成功；荧 光显微镜下，ＨＥＫ２９３Ｔ细胞可见强绿色荧光蛋白表达，慢病毒载体成功共转染入 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，病毒滴度为 ５ ×１０１１ＴＵ／Ｌ。结论：成功构建人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因 ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，病毒滴度达 ５×１０１１ＴＵ／Ｌ。 ［关键词］ＲＮＡ干扰；慢病毒；２９３Ｔ细胞；载体；短发夹 ＲＮＡ；核内不均一核糖核蛋白基因 ［中图分类号］Ｑ７８２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００２７０７（２０１６）０６０６３００５ ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００２７０７．２０１６．０６．００３ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｆ ｓｈＲＮＡｆｏｒＨｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１Ｇｅｎｅ ＬＩＵＹａｏ，ＳＨＩＸｉａｎｇ，ＦＡＮＧＷｅｎ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｃｉａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆｓｈＲＮＡｆｏｒｈｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ：ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ，４ｐａｉｒｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡａｎｄ１ｐａｉｒｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ． ＴａｒｇｅｔｅｄｄｏｕｂｌｅｃｈａｉｎＤＮＡｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｖｅｃｔｏｒｏｆｓｌｏｗｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂ ｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ７２ｈａｆｔｅｒｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｃｏｔｒａｎｓ ｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｏｒｎｏｔ．Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｗａｓｄｅｔｅｒ ｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｂｌａｓｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｌｏｎｅｓｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈ４ｐａｉｒｓｏｆｓｈＲＮＡａｎｄ１ ｐａｉｒｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡｏｌｉｇｏ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｈＲＮＡｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅ２９３ＴＨＥＫｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｓｔｒｏｎｇ ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｓｌｏｗｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｅｄｉｎｔｏ２９３ＴＨＥＫｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｗａｓ５×１０１１ｔｕ／Ｌ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆｓｈＲＮＡ ｆｏｒｈｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅｉｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｉｓ５×１０１１ｔｕ／Ｌ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；２９３Ｔｃｅｌｌｓ；ｖｅｃｔｏｒ；ＳｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ；ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ ０３６ 第 ４１卷 第 ６期 ２０１６年 ６月 贵 州 医 科 大 学 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．６ ２０１６．６  ［基金项目］国家自然科学基金（８１５６０４８１） 贵州医科大学 ２０１３级硕士研究生 通信作者 Ｅｍａｉｌ：２８１１２３９９７＠ｑｑ．ｃｏｍ 网络出版时间：２０１６－０６－１６ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．５０１２．Ｒ．２０１６０６１６．１６４８．０２４．ｈｔｍｌ