第41卷第6期 2016年6月 州医科大学学报 Vol 41 No 6 JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY 2016.6 人 hnrnA2/ BishRNA慢病毒载体的构建 刘瑶*,石祥,方文… 贵州医科大学临床生化教研室,贵州贵阳550004) [摘要]目的:构建人核内不均一核糖核蛋白A2/B1( hnRNPA2/Bl)基因的短发夹RNA(shNA)慢病毒载 体。方法:根据 hnRNA2/B1基因序列,设计4对 hnRNA2/ BI shRNA的干扰序列和1对阴性对照序列(NC ShRNA);合成靶序列双链DNA,与 PGMLV-SCSRNA慢病毒载体连接,通过测序鉴定阳性克隆;用构建的慢病毒 表达载体和包装质粒共转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察转染病毒72h后细胞中绿色荧光蛋白的表达,以 验证共转染是否成功,超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果:经酶切和 BLAST对测序结果比对,重组克 隆中插入的序列与设计合成的4对 shRNA及1对阴性对照 oligo dna完全一致,提示慢病毒载体构建成功;荧 光显微镜下,HEK293T细胞可见强绿色荧光蛋白表达,慢病毒载体成功共转染入HEK293T细胞,病毒滴度为5 10TU/L。结论:成功构建人 hnRNA2/B1基因 shRNA慢病毒载体,病毒滴度达5×10TU/L 关键词]RNA干扰;慢病毒;293T细胞;载体;短发夹RNA;核内不均一核糖核蛋白基因 [中图分类号]q782[文献标识码]A[文章编号]10002707(2016)06-6305 DoI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.003 Construction and Identification of Lentivirus vector of shrna for human hnrnPa2/Bl Gene LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen Department of Clinical Biochemistry, Guizhou Medcial University, Guiyang 550004, Guizhou, China) Abstract] Objective: To construct lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/Bl gene. Meth ods: According to the sequence of hnRNPA2/Bl gene, 4 pairs of interference sequence containing hnRNPA2/Bl shRNA and 1 pairs of interference sequence containing negative control were designed Targeted double chain DNA was synthesized and connected to the lentivirus vector. Positive clones were identified by sequencing. The constructed vector of slow virus expression vector and packaging plasmids were co-transfected to HEK293T cells. The expression of green fluorescent protein was ob- served under fluorescence microscope 72 h after virus transfection in order to verify whether co-trans- fection was successful or not. Ultrafiltration concentrated virus solution and the virus titer was deter- mined. Results: Comparison of the results of enzyme digestion and blast sequencing showed that the insertion sequence of the recombinant clones was completely consistent with 4 pairs of shRNA and 1 pair negative control DNA oligo, indicating that the Lentivirus vector containing shRNA hnRNPA2/B1 was successfully constructed. Under the fluorescence microscope, the 293T HEK cells showed stror green fluorescent protein expression, indicating that the slow virus vector was successfully co-transfect- ed into 293T HEK cells. The virus titer was 5x10 tU/L. Conclusions, Lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/Bl gene is successfully constructed, and the virus titer is 5 x 10" tU/L Key words RNA interference; lentivirus; 293T cells; vector; Short hairpin RNA; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene [基金项目]国家自然科学基金(81560481) 贵州医科大学2013级硕士研究生 通信作者E-mil:281123997@q.com 网络出版时间:2016-06-16网络出版地址:htp://w.cnki.net/kcms/ detail/52.5012.R.20160616.1648.024.hml
人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建 刘 瑶，石 祥，方 文 （贵州医科大学 临床生化教研室，贵州 贵阳 ５５０００４） ［摘 要］目的：构建人核内不均一核糖核蛋白 Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１）基因的短发夹 ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）慢病毒载 体。方法：根据 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因序列，设计 ４对 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ的干扰序列和 １对阴性对照序列（ＮＣ ＳｈＲＮＡ）；合成靶序列双链 ＤＮＡ，与 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，通过测序鉴定阳性克隆；用构建的慢病毒 表达载体和包装质粒共转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，荧光显微镜下观察转染病毒７２ｈ后细胞中绿色荧光蛋白的表达，以 验证共转染是否成功，超滤法浓缩病毒原液并测定病毒滴度。结果：经酶切和 ＢＬＡＳＴ对测序结果比对，重组克 隆中插入的序列与设计合成的 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ完全一致，提示慢病毒载体构建成功；荧 光显微镜下，ＨＥＫ２９３Ｔ细胞可见强绿色荧光蛋白表达，慢病毒载体成功共转染入 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，病毒滴度为 ５ ×１０１１ＴＵ／Ｌ。结论：成功构建人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因 ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，病毒滴度达 ５×１０１１ＴＵ／Ｌ。 ［关键词］ＲＮＡ干扰；慢病毒；２９３Ｔ细胞；载体；短发夹 ＲＮＡ；核内不均一核糖核蛋白基因 ［中图分类号］Ｑ７８２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００２７０７（２０１６）０６０６３００５ ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００２７０７．２０１６．０６．００３ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｏｆ ｓｈＲＮＡｆｏｒＨｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１Ｇｅｎｅ ＬＩＵＹａｏ，ＳＨＩＸｉａｎｇ，ＦＡＮＧＷｅｎ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｃｉａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆｓｈＲＮＡｆｏｒｈｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ：ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ，４ｐａｉｒｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡａｎｄ１ｐａｉｒｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ． ＴａｒｇｅｔｅｄｄｏｕｂｌｅｃｈａｉｎＤＮＡｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｖｅｃｔｏｒｏｆｓｌｏｗｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂ ｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ７２ｈａｆｔｅｒｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｗｈｅｔｈｅｒｃｏｔｒａｎｓ ｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｏｒｎｏｔ．Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｗａｓｄｅｔｅｒ ｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｂｌａｓｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｃｌｏｎｅｓｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈ４ｐａｉｒｓｏｆｓｈＲＮＡａｎｄ１ ｐａｉｒｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡｏｌｉｇｏ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｈＲＮＡｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅ２９３ＴＨＥＫｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｓｔｒｏｎｇ ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｓｌｏｗｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔ ｅｄｉｎｔｏ２９３ＴＨＥＫｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｗａｓ５×１０１１ｔｕ／Ｌ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆｓｈＲＮＡ ｆｏｒｈｕｍａｎｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅｉｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｖｉｒｕｓｔｉｔｅｒｉｓ５×１０１１ｔｕ／Ｌ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；２９３Ｔｃｅｌｌｓ；ｖｅｃｔｏｒ；ＳｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ；ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ ０３６ 第 ４１卷 第 ６期 ２０１６年 ６月 贵 州 医 科 大 学 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．６ ２０１６．６ ［基金项目］国家自然科学基金（８１５６０４８１） 贵州医科大学 ２０１３级硕士研究生 通信作者 Ｅｍａｉｌ：２８１１２３９９７＠ｑｑ．ｃｏｍ 网络出版时间：２０１６－０６－１６ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．５０１２．Ｒ．２０１６０６１６．１６４８．０２４．ｈｔｍｌ
6期 刘瑶等人 hnRNA2/ BishRNA慢病毒载体的构建 目前,癌症的治疗主要以化疗为主,但由于肿(NEB公司,美国), Trizol、 Plasmid大抽Kit(QIA 瘤细胞耐药性的产生,导致肿瘤细胞对多数的化疗GEN公司,美国),DMEM细胞培养基( Hyclone公 药物不敏感口。本课题组前期采用洛铂作用于宫司,美国),胎牛血清(杭州四季青公司),细胞培养 颈癌细胞后,经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异瓶( Corning公司,美国),0.25%胰蛋白酶(Gico 表达蛋白,发现核内不均一核糖核蛋白A2/B1公司,美国)。 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/Bl, 1.2 ik hnRNA2/B1)表达下调2。研究发现 hnRNA2/1.2.1shNA靶点选择及引物的设计针对目 B1基因参与了RNA的拼接、前体信使RNA(Pe-的基因 hnRNA2/B1序列( GeneID3181),利用 mRNA)的成熟和降解,端粒、端粒酶DNA序列的 INVITROGENE公司提供的RNA干扰序列设计软 调节及细胞的增值、分化和凋亡等过程,因此推件,设计多个RNA干扰靶点序列,根据NCB 测对 hnRNA2/B1基因的研究可有助于寻找治疗 BLAST同源性分析,选择最佳的动力学参数的4 肿瘤的新靶点。本研究用含 hnRNA2/Bl的短发个靶点 ShIrA,同时随机选择1个阴性对照NC 夹RNA( short hairpin RNA,shNA)与 PGMLV- shRNA(表1),根据选择的基因序列分别设计并合 SCS5RNA慢病毒载体连接,构建含靶向 hnRNA2/成4对 shRNA及1对阴性对照寡聚单链( oligo) B1 shRNA的重组慢病毒载体,为研究 hnRNA2/DNA(表2)。 BI基因的作用及分子机制奠定基础。 表1 hnRNA2/Bl基因的4条特异性靶序列 1材料与方法 Tab 1 Specific target sequences of hnRNPA2/B1 gene shRNA编号 目标序列 11主要材料及试剂 I-shRNA CAGAAATACCATACCATCAAT pGMLⅤ-SC5RNA慢病毒载体(含表达绿色荧 2-shRNA TGACAACTATGGAGGAGGAAA 光蛋白基因,上海吉满公司)、大肠杆菌菌株DH5a 3.shRNA GGGCTCATGTAACTGTGAAGA (上海吉满公司)、HK293T(中国科学院细胞库)、 4-shRNA GCTTTGTCTAGACAAGAAATG 限制性内切酶 Bamh I、 EcoR I和 Taq polymerase NC-ShRNA TTCTCCGAACGTGTCACGT 表2 shRNA和 NCrnA序列 Tab 2 Oligo of 4 pairs of shRNA and 1 pair NC shRNA oligo名称 Oligo dna序列(5-3) 3935hnRNPA2/Bl-shRNAl-T( EcoRl) gatccGCAGAAATACCATACCATCAATCTCGAGATTGATGGTATGGTATTTCTGTTTTTTg 3935hnRNPA2/Bl-shRNAl-B( BamHI) aattc AAAAAACAGAAATACCATACCATCAATCTCGAGATTGATGGTATGGTATTTCTGCg 3936hnRNPA2/Bl-shRNA2-T( EcoRI) gatccGTGACAACTATGGAGGAGGAAACTCGAGTTTCCTCCTCCATAGTTGTCATTTTTTg 3936hnRNPA/B1-shRNA2-B( BamHI) aattcAAAAAATGACAACTATGGAGGAGGAAACTCGAGTTTCCTCCTCCATAGTTGTCACg 3937hnRNPA/ Bl-shRNA3-T( EcoRl) gatecGGGCTCATGTAACTGTGAAGACTCGAGTCTTCACAGTTACATGAGCCCTTTTTTg 3937hnRNPA2/Bl-shRNA3-B( BamHI) aattcAAAAAAGGGCTCATGTAACTGTGAAGACTCGAGTCTTCACAGTTACATGAGCCCg 3938hnRNPA2/Bl-shRNA4-T( EcoRl) gatccGCTTTGTCTAGACAAGAAATGCTCGAGCATTTCTTGTCTAGACAAAGCTTTTTTg I-shRNA4-B( BamHI) aattc AAAAAAGCTTTGTCTAGACAAGAAATGCTCGAGCATTTCTTGTCTAGACAAAGCg NC-shRNAl-T (EcoRD) gatccGTTCICCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGIGACACGTTCGGAGAACTTTTTTACGCGT NC-shRNAl-B(BamH) attcACGCGTAAAAAAGTTCICOGAACGIGICACGTTCICTTGAAACGIGACACGTTCGGAGAACg 1.2.2 ShRNA慢病毒重组质粒的构建吸取上DNA连接酶1μL,用ddH2O补足体积至15μL,于 下游引物10μL放入PCR管内,95℃30s、72℃25℃水浴中孵育30min,使 shRNA载体与引物的 2min、37℃2min和25℃2min进行退火。酶切连接。把连接产物全部加入感受态细胞中,于冰上 体系为 shRNA5μg、10× Buffer 5μL、BamH2μL放置20min,后于42℃水浴中热击90s。然后迅 和 EcoRI2μL,用dH2O补足至50μL。37℃酶速置于冰上放置2~3min。加入不含抗生素的LB 切30min后进行电泳,电泳结束后,切下包含目的培养基100uL于37℃,150r/min振荡培养45min。 片段的胶条,回收载体。按照3μL回收载体、Oli-3000r/min离心2min,弃掉约850μL的上清液, go引物1μL、T4 dnA ligase buffer 1.5μL和T4将管底的菌液吹打散开,加入到含有相应抗性的培
目前，癌症的治疗主要以化疗为主，但由于肿 瘤细胞耐药性的产生，导致肿瘤细胞对多数的化疗 药物不敏感［１］ 。本课题组前期采用洛铂作用于宫 颈癌细胞后，经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异 表达蛋白，发现核内不均一核糖核蛋白 Ａ２／Ｂ１ （ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２／Ｂ１， ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１）表达下调［２］ 。研究发现 ｈｎＲＮＰＡ２／ Ｂ１基因参与了 ＲＮＡ的拼接、前体信使 ＲＮＡ（Ｐｒｅ ｍＲＮＡ）的成熟和降解，端粒、端粒酶 ＤＮＡ序列的 调节及细胞的增值、分化和凋亡等过程［３］ ，因此推 测对 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的研究可有助于寻找治疗 肿瘤的新靶点。本研究用含 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１的短发 夹 ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）与 ｐＧＭＬＶ ＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，构建含靶向 ｈｎＲＮＰＡ２／ Ｂ１ｓｈＲＮＡ的重组慢病毒载体，为研究 ｈｎＲＮＰＡ２／ Ｂ１基因的作用及分子机制奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 主要材料及试剂 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体（含表达绿色荧 光蛋白基因，上海吉满公司）、大肠杆菌菌株 ＤＨ５α （上海吉满公司）、ＨＥＫ２９３Ｔ（中国科学院细胞库）、 限制性内切酶 ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ和 Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＮＥＢ公司，美国），Ｔｒｉｚｏｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ大抽 Ｋｉｔ（ＱＩＡ ＧＥＮ公司，美国），ＤＭＥＭ细胞培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司），细胞培养 瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ公司，美国），０２５％胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ 公司，美国）。 １．２ 方法 １．２．１ ｓｈＲＮＡ靶点选择及引物的设计 针对目 的基因 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１序列 （ＧｅｎｅＩＤ３１８１），利用 ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＥ公司提供的 ＲＮＡ干扰序列设计软 件，设 计 多 个 ＲＮＡ 干 扰 靶 点 序 列，根 据 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ同源性分析，选择最佳的动力学参数的 ４ 个靶点 ＳｈＮＲＡ，同时随机选择 １个阴性对照 ＮＣ ｓｈＲＮＡ（表 １），根据选择的基因序列分别设计并合 成 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对照寡聚单链（ｏｌｉｇｏ） ＤＮＡ（表 ２）。 表 １ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的 ４条特异性靶序列 Ｔａｂ．１ ＳｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｇｅｎｅ ｓｈＲＮＡ编号 目标序列 １ｓｈＲＮＡ ＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴ ２ｓｈＲＮＡ ＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ３ｓｈＲＮＡ ＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＡ ４ｓｈＲＮＡ ＧＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧ ＮＣｓｈＲＮＡ ＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴ 表 ２ ｓｈＲＮＡ和 ＮＣｓｈＲＮＡ序列 Ｔａｂ．２ Ｏｌｉｇｏｏｆ４ｐａｉｒｓｏｆｓｈＲＮＡａｎｄ１ｐａｉｒＮＣｓｈＲＮＡ ｏｌｉｇｏ名称 ＯｌｉｇｏＤＮＡ序列（５’～３’） ３９３５ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ１Ｔ（ＥｃｏＲＩ） ３９３５ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ１Ｂ（ＢａｍＨＩ） ３９３６ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ２Ｔ（ＥｃｏＲＩ） ３９３６ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ２Ｂ（ＢａｍＨＩ） ３９３７ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ３Ｔ（ＥｃｏＲＩ） ｇａｔｃｃＧＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴｇ ａａｔｔｃＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣｇ ｇａｔｃｃＧＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴｇ ａａｔｔｃＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＴＣＡＣｇ ｇａｔｃｃＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴｇ ３９３７ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ３Ｂ（ＢａｍＨＩ） ３９３８ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ４Ｔ（ＥｃｏＲＩ） ３９３８ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ４Ｂ（ＢａｍＨＩ） ＮＣｓｈＲＮＡ１Ｔ（ＥｃｏＲＩ） ＮＣｓｈＲＮＡ１Ｂ（ＢａｍＨＩ） ａａｔｔｃＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＣＣＣｇ ｇａｔｃｃＧＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴｇ ａａｔｔｃＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＣｇ ｇａｔｃｃＧＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＴＴＴＡＣＧＣＧＴｇ ａａｔｔｃＡＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＡＡＣｇ １．２．２ ＳｈＲＮＡ慢病毒重组质粒的构建 吸取上 下游引物 １０μＬ放入 ＰＣＲ管内，９５℃ ３０ｓ、７２℃ ２ｍｉｎ、３７℃ ２ｍｉｎ和 ２５℃ ２ｍｉｎ进行退火。酶切 体系为 ｓｈＲＮＡ５μｇ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、ＢａｍＨＩ２μＬ 和 ＥｃｏＲＩ２μＬ，用 ｄｄＨ２Ｏ补足至 ５０μＬ。３７℃酶 切 ３０ｍｉｎ后进行电泳，电泳结束后，切下包含目的 片段的胶条，回收载体。按照 ３μＬ回收载体、Ｏｌｉ ｇｏ引物 １μＬ、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅｂｕｆｆｅｒ１５μＬ和 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶 １μＬ，用 ｄｄＨ２Ｏ补足体积至 １５μＬ，于 ２５℃水浴中孵育 ３０ｍｉｎ，使 ｓｈＲＮＡ载体与引物的 连接。把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上 放置 ２０ｍｉｎ，后于 ４２℃水浴中热击 ９０ｓ。然后迅 速置于冰上放置 ２～３ｍｉｎ。加入不含抗生素的 ＬＢ 培养基１０００μＬ于３７℃，１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养４５ｍｉｎ。 ３０００ｒ／ｍｉｎ离心 ２ｍｉｎ，弃掉约 ８５０μＬ的上清液， 将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培 １３６ ６期 刘 瑶等 人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建
贵州医科大学学报 41卷 养皿中,用灭菌的涂布器涂匀,倒置于37℃恒温培液以10为倍数进行病毒梯度稀释,选取所需的细 养箱内过夜培养。挑取单菌落,进行小量摇菌培胞孔,吸去培养基90μL,取90μL慢病毒稀释液 养。测序鉴定阳性克隆。 加入每孔细胞中,放入37℃的细胞培养箱中培养。 1.2.3慢病毒包装将293T细胞置于含10%24h后去除含慢病毒的培养基,加入完全培养基 FBS的1640培养基的10cm培养皿中生长,当细100μL,48h后在荧光显微镜下观察各孔中表达绿 胞长到π0%~80%时细胞换无血清培养基培养1色荧光蛋白的细胞数量,病毒滴度为表达荧光的细 2h后转染。取无菌1.5mLEP管,加入DMEM胞数x稀释倍数 培养基1mL、 shRNA10μg、 Lenti-HG Mⅸx10μL和 HG transgene reagent60μ,混匀后,室温放置15-2结果 20min后均匀滴加到提前换过液的培养皿中共转 染。共转染10~12h时,均匀滴加100× Enhan2.1 PGMLV- SCSRNAI慢病毒载体构建及鉴定 ng buffer(120μL/平皿)促进转染。共转染18 构建的 PGMLV-SC5RNAi慢病毒载体如图1。 20h时换液,48h后,吸取细胞上清液于50mL离心图2B中的泳道4为 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体 管,4℃,4500r/min离心5min;上清液用0.45 um DNA经过BamH和 EcoRI酶切后,形成线性的 滤器过滤后转移到新的离心管中,最后将滤液分批DNA分子;而泳道2和3均为未酶切的质粒DNA 转移到浓缩装置中,4℃,4500r/min离心l0min,可见环形和超螺旋的质粒DNA条带,泳道1、5为 此时滤器上层的液体即为病毒浓缩液。将病毒浓标准分子量参照物( marker),电泳结果验证所提取 缩液以50μL/管进行分装,-80℃保存备用。 的DNA为 PGMLV-SC5RNAi慢病毒载体DNA。 1.2.4病毒滴度的测定将HEK293T细胞培养测序结果经过 BLAST软件比对,重组克隆中插入 至对数生长期,细胞胰酶消化计数,按照8000细的序列与设计合成的4对 shRNA及1对阴性对 胞/孔接种96孔板,37℃培养过夜;细胞长至30%照 oligo dna完全一致(图2),慢病毒载体构建 50%时进行转染,用含有10%FBS的细胞培养成功。 4000bp eGFF 1000bp 250 100bp 3 LTR 注:A为 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体模式,B为电泳结果 图1pGMLⅤ- SCI RNAI慢病毒载体模式及电泳结果 ig. 1 Map of pGMLV-SCl RNAi lentiviral vector 2.2慢病毒载体的包装及滴度测定 hnRNA2/B1- shRNA、 shRNA2、 shRNA3、shR-3讨论 NA4及NC- shRNA病毒感染HEK293T细胞,荧光 显微镜下可见细胞生长良好,细胞内可见强的绿色 RNA干扰( RNA interference,RNAi)是导入一 荧光(图4),说明慢病毒载体包装成功,在含有10条RNA序列,此序列与目的基因的mRNA序列同 ×10-个/L细胞浓度的慢病毒液孔中观察到表达源,因此可以将目的基因的mRNA有效的特异降 绿色荧光蛋白的细胞数均>50。病毒的滴度为5解,使目的基因失去应有的功能。目前,RNA 10TU/L。 干扰的方法最常用的是直接转染 SiRNA和构建 632
养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于 ３７℃恒温培 养箱内过夜培养。挑取单菌落，进行小量摇菌培 养。测序鉴定阳性克隆。 １．２．３ 慢病毒包装 将 ２９３Ｔ细胞置于含 １０％ ＦＢＳ的 １６４０培养基的 １０ｃｍ培养皿中生长，当细 胞长到 ７０％ ～８０％时细胞换无血清培养基培养 １ ～２ｈ后转染。取无菌 １５ｍＬＥＰ管，加入 ＤＭＥＭ 培养基１ｍＬ、ｓｈＲＮＡ１０μｇ、ＬｅｎｔｉＨＧＭｉｘ１０μＬ和 ＨＧｔｒａｎｓｇｅｎｅｒｅａｇｅｎｔ６０μＬ，混匀后，室温放置 １５～ ２０ｍｉｎ后均匀滴加到提前换过液的培养皿中共转 染。共转染 １０～１２ｈ时，均匀滴加 １００×Ｅｎｈａｎ ｃｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（１２０μＬ／平皿）促进转染。共转染 １８～ ２０ｈ时换液，４８ｈ后，吸取细胞上清液于５０ｍＬ离心 管，４℃，４５００ｒ／ｍｉｎ离心 ５ｍｉｎ；上清液用 ０４５μｍ 滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批 转移到浓缩装置中，４℃，４５００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ， 此时滤器上层的液体即为病毒浓缩液。将病毒浓 缩液以 ５０μＬ／管进行分装，－８０℃保存备用。 １．２．４ 病毒滴度的测定 将 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养 至对数生长期，细胞胰酶消化计数，按照 ８０００细 胞／孔接种 ９６孔板，３７℃培养过夜；细胞长至 ３０％ ～５０％时进行转染，用含有 １０％ ＦＢＳ的细胞培养 液以 １０为倍数进行病毒梯度稀释，选取所需的细 胞孔，吸去培养基 ９０μＬ，取 ９０μＬ慢病毒稀释液 加入每孔细胞中，放入 ３７℃的细胞培养箱中培养。 ２４ｈ后去除含慢病毒的培养基，加入完全培养基 １００μＬ，４８ｈ后在荧光显微镜下观察各孔中表达绿 色荧光蛋白的细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细 胞数 ×稀释倍数。 ２ 结果 ２．１ ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体构建及鉴定 构建的 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体如图 １。 图 ２Ｂ中的泳道 ４为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体 ＤＮＡ经过 ＢａｍＨＩ和 ＥｃｏＲＩ酶切后，形成线性的 ＤＮＡ分子；而泳道 ２和 ３均为未酶切的质粒 ＤＮＡ， 可见环形和超螺旋的质粒 ＤＮＡ条带，泳道 １、５为 标准分子量参照物（ｍａｒｋｅｒ），电泳结果验证所提取 的 ＤＮＡ 为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢 病 毒 载 体 ＤＮＡ。 测序结果经过 ＢＬＡＳＴ软件比对，重组克隆中插入 的序列与设计合成的 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对 照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ完全一致（图 ２），慢病毒载体构建 成功。 注：Ａ为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体模式，Ｂ为电泳结果 图 １ ｐＧＭＬＶＳＣ１ＲＮＡｉ慢病毒载体模式及电泳结果 Ｆｉｇ．１ ＭａｐｏｆｐＧＭＬＶ－ＳＣ１ＲＮＡｉｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ ２．２ 慢病毒载体的包装及滴度测定 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２、ｓｈＲＮＡ３、ｓｈＲ ＮＡ４及 ＮＣｓｈＲＮＡ病毒感染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，荧光 显微镜下可见细胞生长良好，细胞内可见强的绿色 荧光（图 ４），说明慢病毒载体包装成功，在含有 １０ ×１０－５个／Ｌ细胞浓度的慢病毒液孔中观察到表达 绿色荧光蛋白的细胞数均 ＞５０。病毒的滴度为 ５ ×１０１１ＴＵ／Ｌ。 ３ 讨论 ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是导入一 条 ＲＮＡ序列，此序列与目的基因的 ｍＲＮＡ序列同 源，因此可以将目的基因的 ｍＲＮＡ有效的特异降 解，使目的基因失去应有的功能［４］ 。目前，ＲＮＡ 干扰的方法最常用的是直接转染ｓｉＲＮＡ和构建 ２３６ 贵 州 医 科 大 学 学 报 ４１卷
6期 刘瑶等人 hnRNA2/ BishRNA慢病毒载体的构建 ShrNA-1序列 IC GAGGATO 22GCAGA4AT 2CCATACCAT2AOTCTCGAGZTT GATGGTATGGTATTTCT GTITTTTGAATTCT ShRNA-2序列 GACGAGGATCCGTGACAACTETGGAGGAGGaAACTCGAGT TGT CATT TTTTGAATTCT ShRNA-3序列 3IGAGGATCCGGGCTCATG2CTGTGA4GA0TCGAGTCT SOCACA GTTACETGAGCCCT 1?TTT GAATT2POG NUMAc 2CGAGGATCC22O AA GAAAT GO GCATETCTTGTCTAGACAAAGCTIETITGAATTCIAG NC- ShRNA序列 图2慢病毒干扰载体中 oligo dna测序 ig. 2 Map of Sequence lentiviral interfered vector 注:A为 shRNA1,B为 shRNA2,C为 shRNA3,D为 shrna4及E为NC- shRNA 图3慢病毒 shRNA感染的HEK293T细胞中绿色荧光蛋白表达 Fig 3 Fluorescence photos of the HEK 293T cells infected by shRNA lentiviral 633
图 ２ 慢病毒干扰载体中 ｏｌｉｇｏＤＮＡ测序 Ｆｉｇ．２ ＭａｐｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄｖｅｃｔｏｒ 注：Ａ为 ｓｈＲＮＡ１，Ｂ为 ｓｈＲＮＡ２，Ｃ为 ｓｈＲＮＡ３，Ｄ为 ｓｈＲＮＡ４及 Ｅ为 ＮＣｓｈＲＮＡ 图 ３ 慢病毒 ｓｈＲＮＡ感染的 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中绿色荧光蛋白表达 Ｆｉｇ．３ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｈｏｔｏｓｏｆｔｈｅＨＥＫ２９３ＴｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙｓｈＲＮＡｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ３３６ ６期 刘 瑶等 人 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ慢病毒载体的构建
贵州医科大学学报 41卷 shRNA载体。在感染的细胞中,shNA序列能够 ev,2006(30):395-402 被加工成需要的 SiRNA,并稳定地传到子代细胞中4] Bernstein E, Caudy A, Hammond SM,etal. Role for a 发挥作用-6。RNA干扰技术现已在肿瘤发生、 bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA inter- ference[J]. Nature, 2001(18): 363-372 发展转移及肿瘤的耐药广泛应用(7-3有研究表[5] Fisherman M, Ketting, Plasterk RH. The genetics of 明利用RNA干扰技术干扰基因的表达后,会增加 RNA silencing[J]. Annu Rev Genet, 2002(36): 489 列腺癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌细胞等对抗癌药 物的敏感性9-1。课题组前期用洛铂处理宫颈癌[6] Brummelkamp TR, Bernards r, Agami R. Caski细胞,经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异 stable expression of short interfering RNAs in mammalian 表达蛋白,发现 hnRNA2/B1表达下调(21。hnRN els[J]. Science,2002(67):550-553. PA2/B基因能参与RNA的一系列生理活动和矿[7]田瑞敏鄢佳程,王含彦,等RNA干扰技术在肿瘤基 因治疗中的研究现状[J].重庆医学,2013(7):811 端粒以及端粒酶的调节,同时对细胞的分化和凋亡 也起到一定作用。特别是对端粒酶的影响非常8] Perry Jh, Emerald bs, Mertani hc,eta. The oncogenic 重要,参与了肿瘤细胞的凋亡{1, hnRNPA2/B1是 potential of growth hormone[J]. Growth Horm IGF Res 种原癌基因,有研究证实 hnRNA2/B1基因在多 2006(5-6):277-289 种癌症中均高表达,干扰 hnRNA2/B会增加抗癌[9]clc, Dowling C, ONeill AJ, et al. Effects of clAP-I clAP-2 and XIAP triple knockdown on prostate cancer 药物对胰腺癌细胞的敏感性, hnRNA2/B1的表达 cell susceptibility to apoptosis, cell survival and prolifera- 降低,抑制肿瘤形成-。利用慢病毒构建的 [J]. Mol cancer,2009(8):39-4 shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于[101] Nozawa h, Tadakuma T,onoT,etal. Small interfering 感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞, RNA targeting epidermal growth factor receptor enhances 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后 chemosensitivity to cisplatin, 5-fluorouracil and docetaxel 可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳 in head and neck squamous cell carcinoma[ J].Cancer Sci,2006(10):1115-1124. 定表达。本研究用含 hnRNA2/B1的 shRNA[11 Fujioka S,sonk, Onda S,etl. Desensitization of 与 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体连接,构建含靶向 hnRNA2/ BI shRNA的重组慢病毒载体,期望为研 ancer cells to TNF-alpha or paclitaxel [J]. Anticancer 究 hnRNA2/B1基因的作用及分子机制奠定基础。 Res,2012(11):4813-4821 本研究设计的4个靶点 ShIRA及1个阴性对照21AhA., Muerkoster s,shrH. targeting ap oligo dna经过测序并经 BLAST对比证实了插入 pathways in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett, 2013 (2):346-358 慢病毒中的干扰序列的方向和序列。将构建的慢[1]Les, Yoon cy, Byun ss,ta. The role of c-flip in 病毒载体和包装质粒共同转染HEK293T细胞,成 Cisplatin Resistance of Human Bladder Cancer Cells[J] 功并且获得高浓度的病毒颗粒 J Urol,2013(6):2327-2334 综上,本研究成功构建高浓度的 hnRNA2/B1[14] Sinha p, Poland j. kohl S,tal. Study of the development shRNA慢病毒载体,为研究 hnRNA2/B1基因的 of chemoresistance in melanoma cell line using proteome 作用及分子机制奠定基础。 analysis[J]. Electrophoresis, 2003(14): 2386-2404 [15]Golan-Gerstl R, Cohen 4参考文献 hnRNPA2/BI regulates tumor suppressor gene splicing neogenic driver in glioblastoma[J].Cancer [1 Shekhar MP. Drug resistance: challenges to effectiv es,2011(13):4 therapy[ J]. Curr Cancer Drug Targets, 2011(5): 613-[16]Gu WJ, Liu HL, Liu WH, et al. Induction of pancreatic ancer cell apoptosis, invasion, migration, and enthance- 2]Li XQ, Ran L, Fang W. Lobaplatin arrests cell cycle pro- ment of chemotherapy sensitivity of gemcitabine, 5-FU gression,induces apoptosis and alters the proteome in h and oxaliplation by hnRNPA2/BI siRNA [J]. Anti r cell Line CaSki[ j]. Biomedicine er durgs,2013(6):566-576 Pharmacotherapy, 2014(3 ): 291-297 [17 ]Sakuma T, Barry MA, Ikeda Y. Lentiviral vectors: Basic [3] Zech VF, Dlaska M, Tzankov A, et al. Prognostic and di- to translational[ J]. Biochem J, 2012(3): 603-618 agnostic relevance of hnRNPA2/BI hnRNPBl and S100 (2016-03-28收稿,2016-05-19修回) A2 in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Detect 中文编辑:吴昌学;英文编辑:刘华 634
ｓｈＲＮＡ载体。在感染的细胞中，ｓｈＲＮＡ序列能够 被加工成需要的 ｓｉＲＮＡ，并稳定地传到子代细胞中 发挥作用［５－６］ 。ＲＮＡ干扰技术现已在肿瘤发生、 发展转移及肿瘤的耐药广泛应用［７－８］ 。有研究表 明利用 ＲＮＡ干扰技术干扰基因的表达后，会增加 列腺癌细胞、头颈部鳞癌、胰腺癌细胞等对抗癌药 物的敏感性［９－１３］ 。课题组前期用洛铂处理宫颈癌 Ｃａｓｋｉ细胞，经双向电泳及质谱技术分析鉴定差异 表达蛋白，发现 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１表达下调［２］ 。ｈｎＲＮ ＰＡ２／Ｂ１基因能参与 ＲＮＡ的一系列生理活动和对 端粒以及端粒酶的调节，同时对细胞的分化和凋亡 也起到一定作用［３］ 。特别是对端粒酶的影响非常 重要，参与了肿瘤细胞的凋亡［１４］ ，ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１是 一种原癌基因，有研究证实 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因在多 种癌症中均高表达，干扰 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１会增加抗癌 药物对胰腺癌细胞的敏感性，ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１的表达 降低，抑制肿瘤形成［１５－１６］ 。利用慢病毒构建的 ｓｈＲＮＡ克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于 感染传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞， 悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后 可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳 定表达［１７］ 。本研究用含 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１的 ｓｈＲＮＡ 与 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体连接，构建含靶向 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ的重组慢病毒载体，期望为研 究 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的作用及分子机制奠定基础。 本研究设计的 ４个靶点 ＳｈＮＲＡ及 １个阴性对照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ经过测序并经 ＢＬＡＳＴ对比证实了插入 慢病毒中的干扰序列的方向和序列。将构建的慢 病毒载体和包装质粒共同转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，成 功并且获得高浓度的病毒颗粒。 综上，本研究成功构建高浓度的 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ ｓｈＲＮＡ慢病毒载体，为研究 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１基因的 作用及分子机制奠定基础。 ４ 参考文献 ［１］ ＳｈｅｋｈａｒＭＰ．Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｔｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＣｕｒｒＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，２０１１（５）：６１３－ ６２３． ［２］ＬｉＸＱ，ＲａｎＬ，ＦａｎｇＷ．Ｌｏｂａｐｌａｔｉｎａｒｒｅｓｔｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅｐｒｏ ｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄａｌｔｅｒｓｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｈｕ ｍａｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＬｉｎｅＣａＳｋｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１４（３）：２９１－２９７． ［３］ＺｅｃｈＶＦ，ＤｌａｓｋａＭ，ＴｚａｎｋｏｖＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｎｄｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｒｅｌｅｖａｎｃｅｏｆｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１，ｈｎＲＮＰＢ１ａｎｄＳ１００ Ａ２ｉｎｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔ ｐｒｅｖ，２００６（３０）：３９５－４０２． ［４］ＢｅｒｎｓｔｅｉｎＥ，ＣａｕｄｙＡＡ，ＨａｍｍｏｎｄＳＭ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｆｏｒａ ｂｉｄｅｎｔａｔｅｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｓｔｅｐｏｆＲＮＡｉｎｔｅｒ ｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１（１８）：３６３－３７２． ［５］ＴｉｊｓｔｅｒｍａｎＭ，ＫｅｔｔｉｎｇＲＦ，ＰｌａｓｔｅｒｋＲＨ．Ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＧｅｎｅｔ，２００２（３６）：４８９－ ５１９． ［６］ＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐＴＲ，ＢｅｒｎａｒｄｓＲ，ＡｇａｍｉＲ．Ａｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２（６７）：５５０－５５３． ［７］田瑞敏，鄢佳程，王含彦，等．ＲＮＡ干扰技术在肿瘤基 因治疗中的研究现状［Ｊ］．重庆医学，２０１３（７）：８１１ －８１４． ［８］ＰｅｒｒｙＪＫ，ＥｍｅｒａｌｄＢＳ，ＭｅｒｔａｎｉＨＣ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ［Ｊ］．ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍＩＧＦＲｅｓ， ２００６（５－６）：２７７－２８９． ［９］ＧｉｌｌＣ，ＤｏｗｌｉｎｇＣ，Ｏ＇ＮｅｉｌｌＡＪ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃＩＡＰ１， ｃＩＡＰ２ａｎｄＸＩＡＰｔｒｉｐｌｅｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｏａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａ ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌＣａｎｃｅｒ，２００９（８）：３９－４７． ［１０］ＮｏｚａｗａＨ，ＴａｄａｋｕｍａＴ，ＯｎｏＴ，ｅｔａｌ．Ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｃｉｓｐｌａｔｉｎ，５ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌａｎｄｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，２００６（１０）：１１１５－１１２４． ［１１］ＦｕｊｉｏｋａＳ，ＳｏｎＫ，ＯｎｄａＳ，ｅｔａｌ．Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆ ＮＦｋａｐｐａＢｆｏｒｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｏＴＮＦａｌｐｈａｏｒｐａｃｌｉｔａｘｅｌ［Ｊ］．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２（１１）：４８１３－４８２１． ［１２］ＡｒｌｔＡ，ＭｕｅｒｋｏｓｔｅｒＳＳ，ＳｃｈａｆｅｒＨ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ，２０１３ （２）：３４６－３５８． ［１３］ＬｅｅＳ，ＹｏｏｎＣＹ，ＢｙｕｎＳＳ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＲｏｌｅｏｆｃＦＬＩＰｉｎ ＣｉｓｐｌａｔｉｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＨｕｍａｎＢｌａｄｄｅｒＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ［Ｊ］． ＪＵｒｏｌ，２０１３（６）：２３２７－２３３４． ［１４］ＳｉｎｈａＰ，ＰｏｌａｎｄＪ，ｋｏｈｌＳ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｕｓｉｎｇｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３（１４）：２３８６－２４０４． ［１５］ＧｏｌａｎＧｅｒｓｔｌＲ，ＣｏｈｅｎＭ，ＳｈｉｌｏＡ，ｅｔａｌ．Ｓｐｌｉｃｉｎｇｆａｃｔｏｒ ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄｉｓａｎｏｎｃｏｇｅｎｉｃｄｒｉｖｅｒｉｎｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１（１３）：４４６４－４４７２． ［１６］ＧｕＷＪ，ＬｉｕＨＬ，ＬｉｕＷＨ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｎｔｈａｎｃｅ ｍｅｎｔｏｆｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，５ＦＵ ａｎｄｏｘａｌｉｐｌａｔｉｏｎｂｙｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｉＲＮＡ ［Ｊ］．Ａｎｔｉ ｃａｎｃｅｒｄｕｒｇｓ，２０１３（６）：５６６－５７６． ［１７］ＳａｋｕｍａＴ，ＢａｒｒｙＭＡ，ＩｋｅｄａＹ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ ｔｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２０１２（３）：６０３－６１８． （２０１６－０３－２８收稿，２０１６－０５－１９修回） 中文编辑：吴昌学；英文编辑：刘 华 ４３６ 贵 州 医 科 大 学 学 报 ４１卷