湖北医药学院&北京协和医院：TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究

TCRy962(OT3)Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究 郭阳12郑静2胡愉2崔莲仙2何维2 (湖北医药学院基础医学院免疫教研室湖北十堰442000 2北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系北京100005) 「摘要]目的:研究TCR962(OT3)Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法:通过 同位素标记技术观察TCRγ9/62(0I3}Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布, 及观察TCRγ9δ2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果:在荷瘤 裸鼠体内∞I-TCRγ962(O3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合,并且其可抑制荷瘤 裸鼠肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。结论:本研究初步证明TCRγ9/62(OT3)Fc 在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路 关键词]TCRγ962(OT3}Fc;肿瘤靶向治疗;荷瘤裸鼠 Anti-tumor Effect ofTCry 9/82(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang 2, ZHENG Jing2, HU Yu2, CUI Lian-xian HE Wei? A School of Basic Medicine, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei 442000; Department o Immunology, BMS& School of Basic Medicine, CAMS PUMC, Beijing 100005, China Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCry9/82(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and distribution of TCRy9/82(OT3-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCRy 9/82(OT3)-Fc. Results In nude mice 9gmTc-TCRy 9/2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumor growth in nude mice and prolong surv ival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCry 9/02(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy Key words: TCRy 9/62(OT3)-Fc, tumor targeting therapy; nude mice bearing tumor [基金项目]国家高技术研究发展计划(863计划)(2006AA02A245) [作者简介]郭阳(1979-),女,湖北文安人,讲师,博士,研究方向:肿瘤免疫学 [通信作者]何维(1955-),男,黑龙江呼兰人,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤免 疫学。E-mail:heweiimu@public.bta.net.cn

[基金项目] 国家高技术研究发展计划(863 计划)（2006AA02A245） [作者简介] 郭 阳（1979-），女，湖北文安人，讲师，博士，研究方向：肿瘤免疫学。 [通信作者] 何 维（1955-），男，黑龙江呼兰人，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤免 疫学。E-mail:heweiimu@public.bta.net.cn TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白体内抗肿瘤效果研究 郭阳 1,2 郑静 2 胡愉 2 崔莲仙 2 何维 2， （1 湖北医药学院基础医学院免疫教研室 湖北十堰 442000； 2 北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系 北京 100005） [摘要]目的：研究 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法：通过 同位素 99mTc 标记技术观察 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内的显像和分布， 及观察 TCR9/2(OT3)-Fc 对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果：在荷瘤 裸鼠体内 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 与肿瘤组织有明显的结合，并且其可抑制荷瘤 裸鼠肿瘤生长速度，延长小鼠生存期。结论：本研究初步证明 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果，为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。 [关键词] TCR9/2(OT3)-Fc；肿瘤靶向治疗；荷瘤裸鼠 Anti-tumorEffect of TCR9/2(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang1,2, ZHENG Jing2, HU Yu2 , CUI Lian-xian2 , HE Wei2 ( 1 School of Basic Medicine,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000; 2Department of Immunology,IBMS& School of Basic Medicine,CAMS & PUMC,Beijing 100005,China) Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCR9/2(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and distribution of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile, we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCR9/2(OT3)-Fc. Results In nude mice 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumor growth in nude mice and prolong survival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy. Key words: TCR9/2(OT3)-Fc; tumor targeting therapy; nude mice bearing tumor

γδT细胞是免疫系统中的一个独特的群体,在外周淋巴细胞库中是数量较小 的亚群,约占正常人外周血CD3T淋巴细胞总数的1%~10%。y6T细胞被视为 处于免疫防御系统的第一线,在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用凹。 近年来γ6T细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明,y6T 细胞对不同性质的多种肿瘤细胞,如黑色素瘤、淋巴瘤凹]、卵巢癌和肺癌刂等均 具有良好的细胞毒作用。TCRy6与 TCRab不同,其识别抗原不具有MHC分子的 限制性,可以直接识别肿瘤细胞抗原凹。为此,我们建立了一个构建新型抗肿瘤 抗体的新策略一将人类TCRγ6识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个 基因工程抗体中,这样将γ6T细胞和抗体二者的优点集于一身,从而形成一种新 型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCRγδ识别肿瘤抗原的主要结构域是CDR3δ,本 项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的γ6T细胞TCR的一个CDR3δ的基因优势 序列(OT3)l5,因此我们利用昆虫表达系统表达了TCR962(OT3}Fc融合蛋白, 既保留完整TCR6识别肿瘤抗原的特点,又兼有抗体的Fc片段。本研究主要通 过同位素标记技术观察TCRγ962(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布,及 TCRγ962(OT3}Fc融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的治疗效果,从而初步研究 ICRγ9/62(0OT3}Fc在体内的抗肿瘤效果。 1材料和方法 1实验动物 BALB裸鼠,4~6周,雌性,均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实 验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房 12细胞株 SKOV3,人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株,以含10%FCS的 DMEM-F12 培养基进行贴壁培养 13主要试剂和仪器 SnCl,无水乙醇,葡庚糖酸钠(GH),2-亚氨基噻吩(2-I)均为AR,Si 公司产品,C-18纯化柱( Sigma公司产品),Na9mcO4(北京原子高科奶站)。 淋巴细胞分离液(天津瀚洋生物有限公司,中国)。ck-8(同仁化学,日本)。 LKBy计数器(瑞典), ICON SPECT(西门子,德国),R905活度计(中 国计量科学研究院),HP100, Zorbax SB-C18 column,EG& E Radioflow Dectector LB509

 T 细胞是免疫系统中的一个独特的群体，在外周淋巴细胞库中是数量较小 的亚群，约占正常人外周血 CD3+ T 淋巴细胞总数的 1%～10%。 T 细胞被视为 处于免疫防御系统的第一线，在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用[1]。 近年来  细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明，  细胞对不同性质的多种肿瘤细胞，如黑色素瘤、淋巴瘤、卵巢癌和肺癌等均 具有良好的细胞毒作用。TCR与 TCRab 不同，其识别抗原不具有 MHC 分子的 限制性，可以直接识别肿瘤细胞抗原[4]。为此，我们建立了一个构建新型抗肿瘤 抗体的新策略－将人类 TCR识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个 基因工程抗体中，这样将  细胞和抗体二者的优点集于一身，从而形成一种新 型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCR识别肿瘤抗原的主要结构域是 CDR3δ，本 项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的 γδT细胞 TCR 的一个 CDR3δ 的基因优势 序列（OT3）[5]，因此我们利用昆虫表达系统表达了 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白， 既保留完整 TCR识别肿瘤抗原的特点，又兼有抗体的 Fc 片段。本研究主要通 过同位素标记技术观察 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白 在荷瘤裸鼠 体内的治疗 效果，从而 初步研究 TCR9/2(OT3)-Fc 在体内的抗肿瘤效果。 1 材料和方法 1.1 实验动物 BALB/c 裸鼠，4～6 周，雌性，均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实 验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房。 1.2 细胞株 SKOV3，人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，以含 10%FCS 的 DMEM-F12 培养基进行贴壁培养。 1.3 主要试剂和仪器 SnCl2，无水乙醇，葡庚糖酸钠（GH），2-亚氨基噻吩（2-IT）均为 A.R，Sigma 公司产品，C-18 纯化柱（Sigma 公司产品），Na99mTcO4（北京原子高科奶站）。 淋巴细胞分离液（ 天津瀚洋生物有限公司，中国）。cck-8（同仁化学，日本）。 LKB γ 计数器（瑞典），ICON SPECT（西门子，德国），R-905 活度计（中 国计量科学研究院），HP 1100，Zorbax SB-C18 column, EG&E Radioflow Dectector LB509

14实验方法 肿瘤反应性TCR?962(OT3)-Fc融合蛋白的表达:利用昆虫表达系统表达 TCR9/62(OT3)Fc融合蛋白,实验方法见本研究前期发表文章6。 荷瘤裸鼠模型的建立:取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞SKOV3,用0.25% 的胰酶消化,用PBS清洗3变,重悬,计数;给裸鼠右前腋下接种1×106/只人 卵巢癌细胞SKOV3,标准饲养,约14d肿瘤长至约0.5cm3,进行下步实验。 TCRγ9/62(OT3)}Fc在荷人卵巢癌(SKOV3)裸鼠体内显像实验:取0.5mg 抗体TCR?9/62(OT3)Fc,加入50μL的2mg/mL2IT,避光,室温反应45min 过PD-10柱纯化:修饰后融合蛋白TCRγ9/62(OT3)Fc加入10μ100mgmL葡 庚糖酸纳溶液和8μ的1 mg/mL SnCl2溶液,立即加入0.2mL2.lmCi的mTe, 室温反应15min后过PD-10柱纯化分离,收集标记产品,测定放射性计数并计 算标记率和产率。收集2.5mL产品,放射性活度1.7mCi。尾静脉注射标记的融 合蛋白02mL(024mCi),分别于于注射后10min、3h、7h和24h进行显像 采集计数为500k,采集炬阵为128×128,ZOOM为3.67,能峰为140keV,能 窗20%,使用低能髙分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况 TCRγ9/62(OT3)Fcc的在荷人卵巢癌(SKOV3)裸鼠体内分布实验:给每只 裸鼠前腋下接种1×106人卵巢癌细胞SKOⅤ3细胞,标准饲养。当肿瘤长至约 07cm时,平均分成2组,每组3只,其中两组尾静脉注射 9mc-TCR?9/62(OT3}Fc,体积0.1mL(1.85MBq,含抗体约25μg)分别于用 药后4h和24h,从眼球取血,扭断颈椎至死,解剖,取心、肝、脾、肾、肺、 胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器,称重,并测定放射性计数,计算每克组织 摄取放射性的百分比(ID%g)和肿瘤/非肿瘤组织放射性(TNT)的比值。 TCRγ9)62(O3}Fc融合蛋白的荷瘤(SKoⅴ3)裸鼠治疗实验:荷瘤裸鼠模 型的建立:方法同前。肿瘤大小为0.1cm3时,将裸鼠随机分为2组:PBS对照 组和治疗组。每次治疗剂量:PBS对照组40μPBS只;抗体治疗组每只荷瘤裸 鼠与肿瘤周边注射40μL,浓度为1uguL(即40g/只)TR?9/62(OT3)Fc。第 一次注射记为第1天,每3d治疗一次,共治疗4次。从第1天起每3d观察肿 瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径,计算肿瘤体积。瘤体体积 计算公式:瘤体体积(mm3)=a×b2×0.5。a:瘤体长径(mm),b:瘤体短径(mm)。 并观察各组小鼠的生存期

1.4 实验方法 肿瘤反应性 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的表达：利用昆虫表达系统表达 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白，实验方法见本研究前期发表文章[6]。 荷瘤裸鼠模型的建立：取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞 SKOV3，用 0.25% 的胰酶消化，用 PBS 清洗 3 变，重悬，计数；给裸鼠右前腋下接种 1×106 /只人 卵巢癌细胞 SKOV3，标准饲养，约 14 d 肿瘤长至约 0.5 cm3，进行下步实验。 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像实验：取 0.5 mg 抗体 TCR9/2(OT3)-Fc，加入 5.0 L 的 2mg/mL 2-IT，避光，室温反应 45 min， 过 PD-10 柱纯化；修饰后融合蛋白 TCR9/2(OT3)-Fc 加入 10 L 100 mg/mL 葡 庚糖酸纳溶液和 8 L 的 1 mg/mL SnCl2 溶液，立即加入 0.2 mL 2.1mCi 的 99mTc， 室温反应 15 min 后过 PD-10 柱纯化分离，收集标记产品，测定放射性计数并计 算标记率和产率。收集 2.5 mL 产品，放射性活度 1.7 mCi。尾静脉注射标记的融 合蛋白 0.2 mL（0.24mCi）,分别于于注射后 10 min、3 h、7 h 和 24 h 进行显像。 采集计数为 500k，采集炬阵为 128×128，ZOOM 为 3.67，能峰为 140 keV，能 窗 20%，使用低能高分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况。 TCR9/2(OT3)-Fc c 的在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内分布实验：给每只 裸鼠前腋下接种 1×106 人卵巢癌细胞 SKOV3 细胞，标准饲养。当肿瘤长至约 0.7 cm 时，平均分成 2 组，每组 3 只 ， 其 中 两 组 尾 静 脉 注 射 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc，体积 0.1 mL（1.85 MBq，含抗体约 2.5μg）分别于用 药后 4 h 和 24 h，从眼球取血，扭断颈椎至死，解剖，取心、肝、脾、肾、肺、 胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器，称重，并测定放射性计数，计算每克组织 摄取放射性的百分比（ID%/g）和肿瘤/非肿瘤组织放射性（T/NT）的比值。 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的荷瘤（SKOV3）裸鼠治疗实验：荷瘤裸鼠模 型的建立：方法同前。肿瘤大小为 0.1 cm3 时，将裸鼠随机分为 2 组：PBS 对照 组和治疗组。每次治疗剂量：PBS 对照组 40 L PBS/只；抗体治疗组每只荷瘤裸 鼠与肿瘤周边注射 40 L，浓度为 1 g/L（即 40 g/只）TCR9/2(OT3)-Fc。第 一次注射记为第 1 天，每 3 d 治疗一次，共治疗 4 次。从第 1 天起每 3 d 观察肿 瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径，计算肿瘤体积。瘤体体积 计算公式：瘤体体积（mm3）=a  b 2  0.5。a：瘤体长径（mm），b：瘤体短径（mm）。 并观察各组小鼠的生存期

2结果 21肿瘤反应性TCRy9/62(OT3)-Fc融合蛋白的表达 17OKD 7OKD non-native native SDS-PAGE SDS-PAGE 图1TCRy962(OT3Fc融合蛋白 SDS-PAGE电泳图 经过 protein G亲和层析,得到纯度较高的TCR79/62OT3)Fc,如图1所示, 变性 SDS-PAGE鉴定,γ9和δ2(OT3)Fc两条链的大小相近,约70KD,非变性 SDS-PAGE鉴定,显示了单一条带,表明是二聚体表达。纯度达90%以上,可以 用于后续实验。 22TCRy982(OT3)Fc在荷人卵巢癌(SKOⅴ3)裸鼠体内显像 SKOV3荷瘤裸鼠分别尾静脉注射mTc-TCRγ962(OT3}Fc选择15min、3h、 7h和24h四个时相进行γ显像。结果如图2所示,注射后7h左右,在荷瘤裸鼠 体内卿mT-TCR79/62OT3)Fc与肿瘤组织有明显的结合,红色箭头所指为肿瘤部 位,这种结合可以一直持续到24h TCRY9/82(OT3)-Fc 图29mc-TCRγ9/62(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内显像 23TCRY962(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的分布 以ID%g(每克组织摄取放射性的百分比)和TNT(肿瘤/非肿瘤组织放射

2 结果 2.1 肿瘤反应性 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的表达 图 1 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳图 经过 protein G 亲和层析，得到纯度较高的 TCR9/2(OT3)-Fc，如图 1.所示， 变性 SDS-PAGE 鉴定，9 和2(OT3)-Fc 两条链的大小相近，约 70 KD，非变性 SDS-PAGE 鉴定，显示了单一条带，表明是二聚体表达。纯度达 90%以上，可以 用于后续实验。 2.2 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像 SKOV3 荷瘤裸鼠分别尾静脉注射 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc 选择 15min、3 h、 7 h 和 24 h 四个时相进行显像。结果如图 2 所示，注射后 7 h 左右，在荷瘤裸鼠 体内 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 与肿瘤组织有明显的结合，红色箭头所指为肿瘤部 位，这种结合可以一直持续到 24 h。 图 2 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内显像 2.3 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内的分布 以 ID%/g（每克组织摄取放射性的百分比）和 T/NT（肿瘤/非肿瘤组织放射

性)比值两个指标评定抗体片段在荷瘤裸鼠体内的分布,选择4h和23h两个时 相观察其分布,结果分别如表1和图3所示。 9mic-TCRγ962(OT3)-Fc融合蛋白在注射后4h,肿瘤组织的ID%g值为 (1.290.15)(ID%g>1),说明肿瘤对抗体的摄取尚可。9mc-TCRy962(OT3)F 融合蛋白在注射后的早期(4h),肝肾等血流丰富的组织摄取率较髙,显然,这 与这些脏器的血流量相关。随着时间的延长,肿瘤/血液的值分别由注射 9mc-TCR9/62013)Fc后4h的(1.3+0.17)到提高到23h的(205±0.28)说 明9mTc-TRy962(OT3)-Fc和肿瘤组织的结合效果随着时间的延长在一定程度 上增加。 表1are-TCRy9/62(O3)-Fe注射荷瘤(SKOⅤ3)裸鼠后 不同时间点在体内的分布 组织 23h ID%/ T/NT ID%o T/NT 血液1.15±0.061.13±0.170.34±002205±028 心0.50±0.05264±0.540.24±001288±020 肝181±0220.73±0.170.970.16073±0.17 脾067±0.07191±0.160.30±0.02230±021 肾760±1.380.17±0.052640.34026±001 肺093±0.16142±0.31043±007162+0.38 胃0.63±0.33249±124047±0.121.55±0.50 肠0.68±0081.91±0.320.20±002341±001 肌肉0.14±0029.55±200005±0.011275±256 骨345±0.300.37±0.03265±0.250.26±0.04 肿瘤1.290.15 0.68±0.07

性）比值两个指标评定抗体片段在荷瘤裸鼠体内的分布，选择 4 h 和 23 h 两个时 相观察其分布，结果分别如表 1 和图 3 所示。 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 融合蛋白在注射后 4 h，肿瘤组织的 ID%/g 值为 (1.29±0.15)（ID%/g>1），说明肿瘤对抗体的摄取尚可。99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 融合蛋白在注射后的早期（4 h），肝肾等血流丰富的组织摄取率较高，显然，这 与这些脏器的血流量相关。随着时间的延长，肿瘤/血液的值分别由注射 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 后 4 h 的（1.13±0.17）到提高到 23 h 的（2.05±0.28）说 明 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 和肿瘤组织的结合效果随着时间的延长在一定程度 上增加。 表 1 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc 注射荷瘤（SKOV3）裸鼠后 不同时间点在体内的分布 组织 4 h 23 h ID%/g T/NT ID%/g T/NT 血液 1.15±0.06 1.13±0.17 0.34±0.02 2.05±0.28 心 0.50±0.05 2.64±0.54 0.24±0.01 2.88±0.20 肝 1.81±0.22 0.73±0.17 0.97±0.16 0.73±0.17 脾 0.67±0.07 1.91±0.16 0.30±0.02 2.30±0.21 肾 7.60±1.38 0.17±0.05 2.64±0.34 0.26±0.01 肺 0.93±0.16 1.42±0.31 0.43±0.07 1.62±0.38 胃 0.63±0.33 2.49±1.24 0.47±0.12 1.55±0.50 肠 0.68±0.08 1.91±0.32 0.20±0.02 3.41±0.01 肌肉 0.14±0.02 9.55±2.00 0.05±0.01 12.75±2.56 骨 肿瘤 3.45±0.30 1.29±0.15 0.37±0.03 2.65±0.25 0.68±0.07 0.26±0.04

TCRy 9/82(oT3)-Fc 87654321 ■23h 86420 864 图3SKOⅴ3荷瘤裸鼠注射 nTe-TCRy962(OT3)-Fc后不同时间的组织分布 24TCRy962(OT3)-Fc融合蛋白的荷瘤(SKOⅤ3)裸鼠体内治疗实验 241TCRγ9δ2(OI3)}Fc抑制荷瘤裸鼠体内移植瘤的生长经过4此瘤周注射 治疗,肿瘤生长情况如图4所示,PBS治疗组(n=5)的肿瘤大小从最初的(0.11 ±0.05)cm3增长到(0.67±0.06)cm3,而治疗组(n=6)的肿瘤大小分别由(0.08 ±003)cm3仅增长到(0.33±0.17)cm3,治疗组肿瘤结节增长速度显著低于 PBS组(P<0.05),提示TCRy962(OT3)Fc具有抑制肿瘤生长的作用。 0 PBS ?982(0T3)-Fc 02 Time( Days 图4治疗后SKOV3荷瘤裸鼠肿瘤结节体积变化 242TCRγ962(OT3)}Fc能延长荷瘤裸鼠的生存期如图5所示,经 TCRγ962(OT3}Fc融合蛋白治疗后的荷瘤裸鼠生存期明显长于PBS对照组有助 于延长SKOV3荷瘤裸鼠得生存期

图 3 SKOV3 荷瘤裸鼠注射 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc 后不同时间的组织分布 2.4 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的荷瘤（SKOV3）裸鼠体内治疗实验 2.4.1 TCR9/2(OT3)-Fc 抑制荷瘤裸鼠体内移植瘤的生长 经过 4 此瘤周注射 治疗，肿瘤生长情况如图 4 所示，PBS 治疗组（n=5）的肿瘤大小从最初的（0.11 ±0.05）cm3 增长到（0.67±0.06）cm3，而治疗组（n=6）的肿瘤大小分别由（0.08 ±0.03） cm3 仅增长到（0.33±0.17）cm3，治疗组肿瘤结节增长速度显著低于 PBS 组（P＜0.05），提示 TCR9/2(OT3)-Fc 具有抑制肿瘤生长的作用。 图 4 治疗后 SKOV3 荷瘤裸鼠肿瘤结节体积变化 2.4.2 TCR9/2(OT3)-Fc 能延长荷瘤裸鼠的生存期 如图 5 所示，经 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白治疗后的荷瘤裸鼠生存期明显长于 PBS 对照组有助 于延长 SKOV3 荷瘤裸鼠得生存期

100 ?92(0T3)-Fc 8 60 51015202530 Time(Days) 图5治疗后SKOV3荷瘤裸鼠的生存期 243TCR9/2(OT3)}Fc治疗对裸鼠没有明显毒性作用在整个治疗过程中,各 治疗组裸鼠一般状况良好,进食和活动正常,体重在治疗前后没有统计学差异(图 6),此次治疗没有对裸鼠造成明显的损伤和伤害,提示TCR962(OT3)-Fc对裸 鼠没有明显毒性作用。 PBS 982(T3)Fc Time( Days) 图6治疗期间裸鼠体质量变化 3讨论 自从 Kohler和 Milstein单克隆抗体技术的问世三十多年以来,抗体技术在 肿瘤靶向治疗中的应用得到了长足的发展。然而,抗体技术在实体肿瘤靶向治疗 中应用受到制约,其中很重要的原因之一是特异性的肿瘤靶抗原的发现还很有

图 5 治疗后 SKOV3 荷瘤裸鼠的生存期 2.4.3 TCR9/2(OT3)-Fc 治疗对裸鼠没有明显毒性作用 在整个治疗过程中，各 治疗组裸鼠一般状况良好，进食和活动正常，体重在治疗前后没有统计学差异（图 6），此次治疗没有对裸鼠造成明显的损伤和伤害，提示 TCR9/2(OT3)-Fc 对裸 鼠没有明显毒性作用。 图 6 治疗期间裸鼠体质量变化 3 讨论 自从 Kohler 和 Milstein 单克隆抗体技术的问世三十多年以来[7]，抗体技术在 肿瘤靶向治疗中的应用得到了长足的发展。然而，抗体技术在实体肿瘤靶向治疗 中应用受到制约，其中很重要的原因之一是特异性的肿瘤靶抗原的发现还很有

限,并且鼠源抗体的人源化过程很可能导致抗体亲和力的下降8。尽管其TCR?6 所识别得肿瘤抗原分子仍然不十分明确,但研究表明了人外周血中的γδT细胞在 体内外对多种肿瘤,尤其是实体肿瘤有很好的杀伤活性。所以,我们选择人来 源的TCRγ9/δ2作为靶向治疗肿瘤的靶向部分是个可以解决肿瘤靶抗原有限及人 源化问题的新策略。我们据此设计的TCR9/62OT3)-Fc融合蛋白,在前期体外 实验中,显示了TCRγ9/62(OT3}-Fc融合蛋白与卵巢癌和淋巴瘤肿瘤抗原较好的 结合特性;本研究,通过同位素9mT标记技术,显示了卿Tc-TCRy962(OT3)Fc 在荷SKOⅤ3瘤裸鼠的体内靶向效果明显;在荷SKO3瘤裸鼠治疗实验结果显 示,TCRγ9δ62(OT3)-rc可抑制肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠的生存期。这些实验结 果充分说明了TCRγ962(OT3}Fc在体内具有较好的抗肿瘤作用 本研究初步证明肿瘤反应性TCR9/620T3}Fc融合蛋白具有TCRy6识别肿 瘤的特性,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路和实验基础。 参考文献 [1] Mak TW, Ferrick DA. The gammadelta T-cell bridge: linking innate and acquired immunity[J]. Nat Med, 1998, 4(7): 764-765 [2] Bensussan A, Lagabrielle JF, Degos L TCR gamma delta bearing lymphocyte clones with lymphokine-activated killer activity against autologous leukemic cells[J]. Blood, 1989, 73(8): 2 077-2080 [3] Zocchi MR, Ferrarini M, Migone N, et al. T-cell receptor V delta gene usage by tumour eactive gamma delta T lymphocytes infiltrating human lung cancer[J]. Immunology 1994,81(2):234-239 [4] Kreslavsky T, von Boehmer H gammadelta TCR ligands and lineage commitment[J].Semin Immunol,2010,22(4)214-221 [5]Xu C Zhang H. Hu H et al. Gammadelta T cells recognize tumor cells via CDR3delta region[J]. Mol Immunol, 2007, 44(4): 302-310 [6】郭阳,郑静,胡愉,等昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ962-Fc融合蛋白及其生物 学功能的初步鉴定门]基础医学与临床,2009,29(12)1268-1272 [7] Kohler G, Milstein C Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J. Nature, 1975, 256(5517): 495-497 [8] Qu Z, Griffiths GL, Wegener WA, et al. Development of humanized antibodies as cancer therapeutics J Methods, 2005, 36(1): 84-9 [9] Nedellec S, Bonneville M, Scotet E. Human Vgamma9Vdelta2 T cells: from signals to functions[J]. Semin Immunol, 2010, 22(4): 199-206

限，并且鼠源抗体的人源化过程很可能导致抗体亲和力的下降[8]。尽管其 TCR 所识别得肿瘤抗原分子仍然不十分明确，但研究表明了人外周血中的 T 细胞在 体内外对多种肿瘤，尤其是实体肿瘤有很好的杀伤活性[9]。所以，我们选择人来 源的 TCR作为靶向治疗肿瘤的靶向部分是个可以解决肿瘤靶抗原有限及人 源化问题的新策略。我们据此设计的 TCR()−Fc 融合蛋白，在前期体外 实验中，显示了 TCR()−Fc 融合蛋白与卵巢癌和淋巴瘤肿瘤抗原较好的 结合特性；本研究，通过同位素 99mTc 标记技术，显示了 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc 在荷 SKOV3 瘤裸鼠的体内靶向效果明显；在荷 SKOV3 瘤裸鼠治疗实验结果显 示，TCR9/2(OT3)-Fc 可抑制肿瘤生长，延长荷瘤裸鼠的生存期。这些实验结 果充分说明了 TCR9/2(OT3)-Fc 在体内具有较好的抗肿瘤作用。 本研究初步证明肿瘤反应性 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白具有 TCR识别肿 瘤的特性，为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路和实验基础。 参考文献 [1] Mak TW,Ferrick DA.The gammadelta T-cell bridge:linking innate and acquired immunity[J]. Nat Med,1998,4(7):764-765. [2] Bensussan A,Lagabrielle JF, Degos L.TCR gamma delta bearing lymphocyte clones with lymphokine-activated killer activity against autologous leukemic cells[J]. Blood, 1989,73(8):2 077-2 080. [3] Zocchi MR, Ferrarini M, Migone N,et al.T-cell receptor V delta gene usage by tumour reactive gamma delta T lymphocytes infiltrating human lung cancer[J]. Immunology, 1994,81(2):234-239. [4] Kreslavsky T, von Boehmer H. gammadeltaTCR ligands and lineage commitment[J]. Semin Immunol, 2010,22(4):214-221. [5] Xu C, Zhang H, Hu H, et al. Gammadelta T cells recognize tumor cells via CDR3delta region[J]. Mol Immunol, 2007, 44(4):302-310. [6] 郭 阳，郑 静，胡 愉，等.昆虫杆状病毒表达系统表达 TCRγ9/δ2-Fc 融合蛋白及其生物 学功能的初步鉴定[J].基础医学与临床,2009,29(12):1 268-1 272. [7] Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature, 1975,256(5 517):495-497. [8] Qu Z, Griffiths GL, Wegener WA, et al. Development of humanized antibodies as cancer therapeutics[J]. Methods, 2005,36(1):84-95. [9] Nedellec S, Bonneville M, Scotet E . Human Vgamma9Vdelta2 T cells: from signals to functions[J]. Semin Immunol, 2010,22(4):199-206