《病毒学报》（山东大学）：基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

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病毒学报病毒学报 Chinese ournal of virology 2切Ss1008CN11!65/R 《病毒学报》网络首发论文题目基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究作者刘姗姗,陶泽新,王素婷,周楠,林小娟,宋艳艳,徐爱强 DOI 10. 13242/j cnki. bingduxuebao. 003356 收稿日期 2018-01-16 网络首发日期:2018-0408 引用格式: 刘姗姗,陶泽新,王素婷,周楠,林小娟,宋艳艳,徐爱强.基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究.病毒学报 https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 n*知网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出版管理条例》和《期刊出版管理规定》的有关规定:学术研究成果具有创新性、科学性和先进性,符合编辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其他侵权行为:稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑出版的技术标准,正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容, 只可基于编辑规范进行少量文字的修改出版确认:纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊(光盘版)》电子杂志社有限公司签约,在《中国学术期刊(网络版)》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊(网络版)》是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN2096-4188,CN116037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版

病毒学报 Chinese Journal of Virology ISSN 1000-8721,CN 11-1865/R 《病毒学报》网络首发论文题目：基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究作者：刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强 DOI： 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 收稿日期： 2018-01-16 网络首发日期： 2018-04-08 引用格式：刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强．基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究．病毒学报. https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 网络首发：在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出版管理条例》和《期刊出版管理规定》的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容，只可基于编辑规范进行少量文字的修改。出版确认：纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司签约，在《中国学术期刊（网络版）》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊（网络版）》是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版

DOl:10.13242/ cnki. bingduxuebao.003356网络首发时间:2018-04-081323:00 网络首发地址:http://kns.cnki.net/kcms/detai/11.1865.r.20180406.1825.008.html 病毒学报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究刘姗姗',陶泽新ξ,王素婷ξ,周楠',林小娟2,宋艳艳,徐爱强 1,2 (1.山东大学公共卫生学院,济南250012;2.山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院山东省传染病预防控制重点实验室,济南250014) 摘要:为了解生活污水中诺如病毒( norovirus,NoV)检出情况、基因型分布和分子流行病学特征,进一步探索环境监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性,本研究于2016年1~12月在山东省济南和临沂两地采集生活污水,通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的24份污水样品进行浓缩后,提取核酸,经过逆转录一聚合酶链反应扩增 NoV VP1基因片段,经TA克隆后测序,进行分型和系统进化树分析。结果显示,监测地区生活污水标本中 GI的检出率为100%,GⅡ为95.8%。共获得412条NoV序列,分别属于6个Gl基因型和8个GⅡl基因型,其中Gl (32.3%,133/412)、GI.3(14.1%,58/412)和G.17(25.7%,106/412)检出数量最多。G.17检出序列均属于Ka masaki3o8变异株,而前些年大流行的G4的检出序列占比仅1.0%,属于 Sydney2012变异株。本研究描述了 2016年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征,证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循环的诺如病毒的遗传多样性关键词:诺如病毒;急性胃肠炎;分子流行病学;环境监测中图分类号:R373.2文献标识码:A 诺如病毒( Norovirus,NoV),属于人类杯状病系统报告,在2012~2016年间我国24个省96个城毒科( Human calicivirus,HuCV)诺如病毒属,于市共发生313次由NoV引起的暴发事件,其中2016 1972年通过免疫电镜技术首次在美国俄亥俄州诺年NoV暴发109次。由于NoV无症状携带者和瓦克地区暴发的流行性腹泻疫情中发现,是首个被不选择就医的轻症患者较多,所以临床病例的监测确认的引起人类急性胃肠炎的病毒口。NoV基因组数据不能完全反映病原真正的流行病学特征,生活为单股正链RNA,全长约75kb,分为三个开放阅污水中检测到的NoV序列和人群中胃肠炎病例的读框架( Open Reading Frames,ORFs),ORF1编码NoV序列密切相关。鉴于此本研究在2016年对非结构蛋白,ORF2和ORF3分别编码主要衣壳蛋山东省济南和临沂两地城市污水中的NoV进行了白VP1和次要结构蛋白VP2。根据VP1蛋白编码监测分析,获取监测地区NoV分子流行病学及其系的序列不同可分为7个基因群(GI~GV),其中GI、统进化特征,以探索胃肠炎病毒环境监测的重要 G和GⅣV可感染人类。性,并为当地NoV胃肠炎的防控提供科学依据。 NoV是引起人类急性胃肠炎的主要原因之可导致散发或暴发。在全球范围内,约五分之一的材料与方法腹泻病例由NoV引起四。NoV所致胃肠炎虽然属于自限性疾病,但可导致婴儿和老年人产生严重的 1污水的采集与浓缩症状甚至死亡。国家突发公共卫生事件信息管理本研究以山东省济南和临沂两地为监测点,于 2016年1~12月每月中旬分别采集两地污水处理厂收稿日期:201801-16;修回日期:2018-02-25 进水口处的污水标本1L,所采水样低温运输至实基金项目:泰山学者工程专项经费资助(ts.20151105);国家自验室4℃保存,于24小时内采用阴离子膜吸附洗脱然科学基金项目(81573209).题目:环境污水中人类胃肠炎病毒的法对采集的污水进行100倍的浓缩,最终浓缩液型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系;山东省自然科学基金项目(ZR2014HM076),题目:基于环境污水监测的诺如体积为10ml,置于-80℃冻存。病毒基因型分布和分子流行病学研究 2病毒RNA的提取作者简介姗(1993-),女,湖北省襄阳市人,硕士研究生使用美国 QIAGEN公司的 QIAamp Viral 主要从事诺如病毒方面的研究,E-mail:shanshanyou@foxmail.com ,通讯作者:宋艳艳(1963-),副教授,T61:0531-88625. RNA MIni Kit试剂盒,根据使用说明操作,从140μl E-mail: yysong(a sdu. edu. cn;徐爱强(1963-),主任医师,T 污水浓缩液中提取总RNA,加入11l(40U)RNa 0531-82679606.e-mail:aqxuepi(@163.com sin,置于-80℃冻存

病毒学报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究刘姗姗 1 ，陶泽新 2 ，王素婷 2 ，周楠 1 ，林小娟 2 ，宋艳艳 1* ，徐爱强 1，2* （1.山东大学公共卫生学院，济南 250012； 2.山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院山东省传染病预防控制重点实验室，济南 250014）摘要：为了解生活污水中诺如病毒（Norovirus，NoV）检出情况、基因型分布和分子流行病学特征，进一步探索环境监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性，本研究于 2016 年 1~12 月在山东省济南和临沂两地采集生活污水，通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的 24 份污水样品进行浓缩后，提取核酸，经过逆转录-聚合酶链反应扩增 NoV VP1 基因片段，经 TA 克隆后测序，进行分型和系统进化树分析。结果显示，监测地区生活污水标本中 GI 的检出率为 100%，GII 为 95.8%。共获得 412 条 NoV 序列，分别属于 6 个 GI 基因型和 8 个 GII 基因型，其中 GI.6 （32.3%，133/412）、GII.3（14.1%，58/412）和 GII.17（25.7%，106/412）检出数量最多。GII.17 检出序列均属于 Ka⁃ wasaki 308 变异株，而前些年大流行的 GII.4 的检出序列占比仅 1.0%，属于 Sydney 2012 变异株。本研究描述了 2016 年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征，证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循环的诺如病毒的遗传多样性。关键词：诺如病毒；急性胃肠炎；分子流行病学；环境监测中图分类号：R373.2 文献标识码：A 诺如病毒（Norovirus，NoV），属于人类杯状病毒科（Human Calicivirus，HuCV）诺如病毒属，于 1972 年通过免疫电镜技术首次在美国俄亥俄州诺瓦克地区暴发的流行性腹泻疫情中发现，是首个被确认的引起人类急性胃肠炎的病毒［1］。NoV 基因组为单股正链 RNA，全长约 7.5 kb，分为三个开放阅读框架（Open Reading Frames，ORFs），ORF1 编码非结构蛋白，ORF2 和 ORF3 分别编码主要衣壳蛋白 VP1 和次要结构蛋白 VP2。根据 VP1 蛋白编码的序列不同可分为 7 个基因群（GI~GVI），其中 GI、 GII和 GIV 可感染人类。 NoV 是引起人类急性胃肠炎的主要原因之一，可导致散发或暴发。在全球范围内，约五分之一的腹泻病例由 NoV 引起［2］。NoV 所致胃肠炎虽然属于自限性疾病，但可导致婴儿和老年人产生严重的症状甚至死亡。国家突发公共卫生事件信息管理系统报告，在 2012~2016 年间我国 24 个省 96 个城市共发生 313 次由 NoV 引起的暴发事件，其中 2016 年 NoV 暴发 109 次［3］。由于 NoV 无症状携带者和不选择就医的轻症患者较多，所以临床病例的监测数据不能完全反映病原真正的流行病学特征，生活污水中检测到的 NoV 序列和人群中胃肠炎病例的 NoV 序列密切相关［4］。鉴于此，本研究在 2016 年对山东省济南和临沂两地城市污水中的 NoV 进行了监测分析，获取监测地区 NoV 分子流行病学及其系统进化特征，以探索胃肠炎病毒环境监测的重要性，并为当地 NoV 胃肠炎的防控提供科学依据。材料与方法 1 污水的采集与浓缩本研究以山东省济南和临沂两地为监测点，于 2016 年 1~12 月每月中旬分别采集两地污水处理厂进水口处的污水标本 1 L，所采水样低温运输至实验室 4℃保存，于 24 小时内采用阴离子膜吸附洗脱法对采集的污水进行 100 倍的浓缩［5］，最终浓缩液体积为 10 ml，置于-80℃冻存。 2 病毒 RNA 的提取使用美国 QIAGEN 公司的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒，根据使用说明操作，从 140 μl 污水浓缩液中提取总 RNA，加入 1 μ（l 40 U）RNa⁃ sin，置于-80℃冻存。收稿日期：2018⁃01⁃16；修回日期：2018⁃02⁃25 基金项目：泰山学者工程专项经费资助（ts.201511105）；国家自然科学基金项目（81573209），题目：环境污水中人类胃肠炎病毒的型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系；山东省自然科学基金项目（ZR2014HM076），题目：基于环境污水监测的诺如病毒基因型分布和分子流行病学研究。作者简介：刘姗姗（1993-），女，湖北省襄阳市人，硕士研究生，主要从事诺如病毒方面的研究，E-mail：shanshanyou@foxmail.com ∗ 通讯作者：宋艳艳（1963-），副教授，Tel：0531-88382625， E - mail：yysong@sdu. edu. cn；徐爱强（1963 -），主任医师，Tel： 0531-82679606，E-mail：aqxuepi@163.com DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 网络首发时间：2018-04-08 13:23:00 网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1865.R.20180406.1825.008.html

病毒学报 3逆转录-聚合酶链反应的诺如病毒序列为412条。包括234个G序列和使用 SuperScript Ill One- step RT- PCR Sys-178个Gl序列,分别属于6个GI基因型 tem with Platinum Tag一步法试剂盒对 NoV GI和(G1.1~G1.6)和8个GI基因型(GI1、GI.2、GI3 GI的ORF1和ORF2部分片段进行基因扩增。扩GI14、GI.5、GI.9、GI.13和GI.17)(表1)。GI主增 NoV GI基因组所用引物为G1-SKF(CTG要基因型为GL.6(56.8%,133/234),其次为GI.2 CCC GAA TTY GTA AAT GA)F G1-SKR((9.4%, 22/234) GI. 3(10.7%, 25/234)FLl GI.5 CCA ACC CAR CCA TTR TAC A);扩增NoV(15.8%,37/234)。GⅡ主要基因型为GI.17 GII基因组所用引物为COG2F( CAR GAR BCN(59.6%,106/178),其次为GI.3(32.6%,58/178)。 TG TTY AGR TGG ATG AG)和G2-SKR两地检出较多的基因型依次为GI.6、GI.17和 ( CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT)。GI3。 RT—PCR反应体系体积为50μL,程序设置为 NoV基因型分布存在一定程度的地区差异,在 50℃30min,94℃2min;94℃15s,50℃30s,68℃1济南检出5个GI基因型和8个GIl基因型,在临沂 min,共40个循环;68℃5min后转4℃保存。检出6个GI基因型和4个G∏基因型。G1.1仅见于 4PCR产物的回收、克隆和测序临沂,GII.1、GI9、GI.13和GIL.15仅见于济南。其 NoV GI和GIl的引物扩增的目的片段大小分他基因型虽在两地均有分布,但检出频率存在一定别为330bp和387bp,RT一PCR反应产物用1.5%差异,除GI.2济南较多见外,其他各型均临沂多见的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,符合上述片段大小的且GI.17和GI3更为突出。扩增产物判断为阳性。使用 QIAquick Gel Extrac 总体来看NoV无明显季节分布差异,主要流行 tion Kit试剂盒对阳性产物进行切胶回收,通过TA型GL.6和GI.17全年均有检出,GI3多数月份可克隆连接到pGEM@- T Easy载体中,连接产物通检出。GL.1和GI4主要见于寒冷季节,但检出频过热休克法转入至感受态大肠杆菌JM109细胞中。率较低再经过蓝白斑筛选,每份标本挑取GⅠ和GⅡ的阳性2同源性比较和序列分析克隆各10个,共挑取480个阳性克隆,送至上海生同源性比较显示,本次研究所获取的各型别物工程股份有限公司测序。 oV序列氨基酸同源性均较高,大多数同一型别有 5基因分型和系统进化分析较高的核苷酸同源性,少数型别GL.3、GL.5、GI.6和使用 Bioedit5.0.6软件进行序列剪切、比对和GIL3的型内核苷酸同源性略低,且该型别在济南和同源性分析,使用NoⅤ在线分型工具(htp://www.临沂两地内均显示同源性略低。(表2)。 rivm. nl/mpf/ norovirus/ typingtool)对获得的NoV 本研究选取山东两监测地区NoV主要流行型 GI和GⅡ序列进行分型。使用Mage5.0软件基于别(Gl6、GI.3和GI17)序列与国内外其他参考序 Neighbor- Joining法构建系统发生树,通过1000次列比较、构建基于VP1编码区部分序列的系统进化重复 bootstrap检验评估建树可靠性。树,分离地点为同一城市且核苷酸同源性大于98% 的序列仅选取1条为代表(图1)。结果系统发生学分析显示GL.6序列可分为两个基因簇(基因簇A和基因簇B),大部分GI.6序列都属 NoV检出情况与型别分布于基因簇A,提示该分支是山东GI6的主要传播本研究在济南、临沂两地采集污水处理厂处理链。除序列(JN596)和(LY1620)外,GI.6的型内核前污水,每月每地采集1份标本,从2016年1月采集苷酸同源性为971%~100.0%。序列(JN596)和至12月,共计24份污水标本。经RT一PCR检测分(LY1620)与GI.6其他序列的同源性较低,均为析,24份标本中有23份标本均检出GI和GⅡ基因872%~88.8%,与南宁参考序列(KM246916)亲缘型,济南9月标本仅检出GI未检出GIl送去测序关系较近,处于同一个进化簇内,且与其有较高的的480个克隆中,由于测序不成功损失部分序列,且核苷酸同源性,分别为984%和96.8% 获得的序列中有部分为非特异性序列,包括短片段 GII3序列和广东参考序列(KY407194)核苷酸插入、人类基因组序列、植物病毒序列等,最终获得同源性为97.7%~100.0%,与其有较近的亲缘关

病毒学报 3 逆转录-聚合酶链反应使用 SuperScript III One-step RT-PCR Sys⁃ tem with Platinum Taq 一步法试剂盒对 NoV GI 和 GII 的 ORF1 和 ORF2 部分片段进行基因扩增。扩增 NoV GI 基因组所用引物为 G1-SKF（CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA）和 G1-SKR（ CCA ACC CAR CCA TTR TAC A）；扩增 NoV GII 基因组所用引物为 COG2F（CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG）和 G2-SKR （CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT）［6］。 RT-PCR 反应体系体积为 50 μL，程序设置为： 50℃ 30 min，94℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共 40 个循环；68℃ 5 min 后转 4℃保存。 4 PCR 产物的回收、克隆和测序 NoV GI 和 GII 的引物扩增的目的片段大小分别为 330 bp 和 387 bp，RT-PCR 反应产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，符合上述片段大小的扩增产物判断为阳性。使用 QIAquick Gel Extrac⁃ tion Kit 试剂盒对阳性产物进行切胶回收，通过 TA 克隆连接到 pGEM®-T Easy 载体中，连接产物通过热休克法转入至感受态大肠杆菌 JM109 细胞中。再经过蓝白斑筛选，每份标本挑取 GI 和 GII 的阳性克隆各 10 个，共挑取 480 个阳性克隆，送至上海生物工程股份有限公司测序。 5 基因分型和系统进化分析使用 BioEdit 5.0.6 软件进行序列剪切、比对和同源性分析，使用 NoV 在线分型工具（http：//www. rivm. nl / mpf / norovirus / typingtool）对获得的 NoV GI 和 GII 序列进行分型。使用 Mage 5.0 软件基于 Neighbor-joining 法构建系统发生树，通过 1000 次重复 bootstrap 检验评估建树可靠性。结果 1 NoV 检出情况与型别分布本研究在济南、临沂两地采集污水处理厂处理前污水，每月每地采集 1 份标本，从 2016 年 1 月采集至 12 月，共计 24 份污水标本。经 RT-PCR 检测分析，24 份标本中有 23 份标本均检出 GI 和 GII 基因型，济南 9 月标本仅检出 GI 未检出 GII。送去测序的 480 个克隆中，由于测序不成功损失部分序列，且获得的序列中有部分为非特异性序列，包括短片段插入、人类基因组序列、植物病毒序列等，最终获得的诺如病毒序列为 412 条。包括 234 个 GI 序列和 178 个 GII 序列，分别属于 6 个 GI 基因型（GI.1~GI.6）和 8 个 GII 基因型（GII.1、GII.2、GII.3、 GII.4、GII.5、GII.9、GII.13 和 GII.17）（表 1）。GI 主要基因型为 GI. 6（56.8%，133 / 234），其次为 GI. 2 （9.4%，22 / 234）、GI. 3（10.7%，25 / 234）和 GI. 5 （15.8%，37 / 234）。 GII 主要基因型为 GII. 17 （59.6%，106/178），其次为 GII.3（32.6%，58/178）。两地检出较多的基因型依次为 GI. 6、GII. 17 和 GII.3。 NoV 基因型分布存在一定程度的地区差异，在济南检出 5 个 GI 基因型和 8 个 GII 基因型，在临沂检出 6 个 GI 基因型和 4 个 GII 基因型。G1.1 仅见于临沂，GII.1、GII.9、GII.13 和 GII.15 仅见于济南。其他基因型虽在两地均有分布，但检出频率存在一定差异，除 GI.2 济南较多见外，其他各型均临沂多见，且 GII.17 和 GII.3 更为突出。总体来看 NoV 无明显季节分布差异，主要流行型 GI.6 和 GII.17 全年均有检出，GII.3 多数月份可检出。GI.1 和 GII.4 主要见于寒冷季节，但检出频率较低。 2 同源性比较和序列分析同源性比较显示，本次研究所获取的各型别 NoV 序列氨基酸同源性均较高，大多数同一型别有较高的核苷酸同源性，少数型别 GI.3、GI.5、GI.6 和 GII.3 的型内核苷酸同源性略低，且该型别在济南和临沂两地内均显示同源性略低。（表 2）。本研究选取山东两监测地区 NoV 主要流行型别（GI.6、GII.3 和 GII.17）序列与国内外其他参考序列比较、构建基于 VP1 编码区部分序列的系统进化树，分离地点为同一城市且核苷酸同源性大于 98% 的序列仅选取 1 条为代表（图 1）。系统发生学分析显示 GI.6 序列可分为两个基因簇（基因簇 A 和基因簇 B），大部分 GI.6 序列都属于基因簇 A，提示该分支是山东 GI.6 的主要传播链。除序列（JN596）和（LY1620）外，GI.6 的型内核苷酸同源性为 97.1%~100.0%。序列（JN596）和（LY1620）与 GI. 6 其他序列的同源性较低，均为 87.2%~88.8%，与南宁参考序列（KM246916）亲缘关系较近，处于同一个进化簇内，且与其有较高的核苷酸同源性，分别为 98.4% 和 96.8%。 GII.3 序列和广东参考序列（KY407194）核苷酸同源性为 97.7%~100.0%，与其有较近的亲缘关 · 2 ·

刘姗姗，等 . 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究系。多数 GII. 3 序列属于同一个分支，仅序列（LY540-2）属于另一个分支，该分支序列与广东参考序列（KY407194）核苷酸同源性为 100%。本研究共获得 4 条 GII.4 序列，均属于 Sydney 2012 变异株，与原型株（JX459908）的核苷酸同源性为 97.7%~98.0%。 GII. 17 的型内核苷酸同源性为 97.5%~ 100.0%，GII.17 各序列聚集在同一个分支，均属于 Kawasaki 308（LC037415）变异株。大部分序列与上海参考序列（KU953397、KU953394）亲缘关系较近，核苷酸同源性为 98.9%~100.0%，数条序列与珠海变异株（KT253245）［7］、江苏变异株（KR270448）［8］和意大利参考序列（KT346356）处于同一个进化簇内，核苷酸同源性均为 99.6%~ 100%。 3 条序列（LY542 -2、LY542-3 和 LY818-9）与 Kawasaki 308 变异株核苷酸同源性为 100%，分离地点皆为临沂市。表 1 山东监测地区城市污水中 NoV 的数量 Table 1 Number of NoV sequences detected in sewage in Shandong Province，China GI.1 GI.2 GI.3 GI.4 GI.5 GI.6 GII.1 GII.2 GII.3 GII.4 0 1 1 0 0 8 0 0 0 0 0 3 0 0 0 8 1 0 1 0 0 3 0 0 1 8 0 0 1 0 0 2 0 0 2 8 0 0 0 0 0 2 0 0 1 7 0 0 2 0 0 2 0 1 1 6 0 0 1 0 0 1 1 0 1 6 0 0 3 0 0 0 3 0 0 6 0 0 4 0 0 0 3 0 0 4 0 0 0 0 0 0 2 2 5 1 0 0 1 0 0 0 0 0 2 8 0 1 3 2 0 0 0 0 8 2 0 0 8 0 0（0） 14 （11.7） 10 （8.3） 3（2.5） 21 （17.5） 72（60） 1（1.4） 1（1.4） 24 （33.3） 2（2.8） 0 0 2 2 0 6 0 0 9 1 0 1 1 1 0 6 0 1 8 1 0 1 2 0 0 6 0 0 3 0 0 0 0 0 3 7 0 0 0 0 0 1 2 0 3 4 0 0 3 0 0 0 1 0 3 4 0 0 2 0 0 0 1 1 3 4 0 0 1 0 0 0 0 0 3 7 0 0 1 0 0 5 0 1 1 3 0 0 1 0 3 0 2 1 0 4 0 0 2 0 5 0 1 0 0 4 0 0 4 0 0 0 3 0 0 6 0 0 0 0 8（7.0） 8（7.0） 15（13.2） 6（5.3） 16（14.0） 61（53.5） 0（0） 1（0.9） 34（3.1） 2（1.9） 8（3.4） 22（9.4） 25（10.7） 9（3.8） 37（15.8） 133 （56.8） 1（0.6） 2（1.1） 58（32.6） 4（2.2） Geno⁃ type Jinan Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Linyi Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Sum （%1 ） · 3 ·

病毒学报 GII.9 GII.13 GII.15 GII.17 Total 0 0 0 2 12 0 0 0 1 14 0 0 0 1 14 0 0 0 2 14 1 2 0 3 18 0 1 0 7 19 0 0 0 7 19 0 0 1 4 18 0 0 0 0 7 0 0 0 8 19 0 0 1 1 18 0 1 0 1 20 1（1.4） 4（5.6） 2（2.8） 37 （51.4） 192 0 0 0 0 20 0 0 0 0 19 0 0 0 6 18 0 0 0 7 17 0 0 0 6 19 0 0 0 6 16 0 0 0 5 15 0 0 0 7 18 0 0 0 9 20 0 0 0 8 20 0 0 0 6 20 0 0 0 9 18 0（0） 0（0） 0（0） 69（65.1） 220 1（0.6） 4（2.2） 2（1.1） 106 （59.6） 412 续表 Geno⁃ type Jinan Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Linyi Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Sum （%1 ） Note：1 constituent ratio within a genogroup. 讨论本研究监测地区生活污水中 NoV GI 和 NoV GII 的检出率为 100%，显示 NoV 在当地的高流行态势，与邓丽丽［9］等人对南宁市的监测结果一致。本次共检出 14 种 NoV 基因型在山东监测地区的城市污水管网中循环，其中检出数量最多的两个基因型为 GI.6 和 GII.17，且全年各月份都有检出，表明 GI.6 和 GII.17 在 2016 年山东监测地区有较高的流行强度。济南检出 8 个 GII 基因型临沂仅检出 4 个 GII 基因型，说明 NoV 在监测地区间型别分布存在一定的差异。表 2 山东环境监测地区 NoV 各基因型 VP1 核苷酸和氨基酸同源性 Table 2 Nucleotide identities among Shandong sequence Genotypes GI.1 GI.2 GI.3 GI.4 GI.5 GI.6 GII.1 GII.2 GII.3 GII.4 GII.9 GII.13 GII.15 GII.17 Nucleotide identities（%） Jinan / 98.4~100 84.7~100 98.0~99.0 84.7~100 88.2~100.0 / / 96.7~100.0 98.3 / 97.0~99.0 97.0 98.9~100.0 Linyi 99.3~100.0 98.7~100 84.7~100 99.0~99.6 84.7~100 87.2~100.0 / / 97.0~100.0 99.3 / / / 98.2~100.0 Jinan and Linyi 99.3~100.0 98.4~100.0 84.3~100.0 98.0~99.6 84.3~100.0 87.2~100.0 / 95.7 94.0~100.0 97.7~99.3 / 97.0~99.0 97.0 97.5~100.0 Amino acids（%） Jinan / 97.1~100 98.0~100 97.1~99.0 97.1~100.0 96.1~100.0 / / 95.0~100.0 98.0 / 98.0~100.0 93.7 97.8~100.0 Linyi 99.0~100.0 99.0~100.0 95.2~100.0 99.0~100.0 97.1~100.0 94.2~100.0 / / 96.0~100.0 100.0 / / / 96.8~100.0 Jinan and Linyi 99.0~100.0 97.1~100.0 95.2~100.0 97.1~100.0 96.1~100.0 94.2~100.0 / 98 89.2~100.0 97.0~100.0 / 98.0~100.0 93.7 96.8~100.0 Note：“/”means“cannot be calculated”. · 4 ·

刘姗姗,等.基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 HI-y Notes: Phylogenetic relationship of Shandong and other sequence. GL.6, Gll.3 and GIl. 17 are illustrated in a to c respectively. O Isolates from wage; D reference sequence 图1G1.6、GI3和GI17系统进化树 Figure 1 Phylogenetic trees of G1. 6, Gll.3 and GIl. 17 sequences 核苷酸同源性分析表明,同一地区同一时间获为2016年,表明两者之间可能存在远距离传播。此取的毒株序列、不同地区间或不同时间内获取的毒前已有研究表明,将生活污水里的NoV与世界各地株序列的型内核苷酸同源性都可以达到100%,这分离株进行核苷酸同源性比较和系统发生学分析表明一些传播链在人群中存在时空与地域的连续有助于明确NoV的传播路径,追踪起源。循环。有研究报道,2014~2015年寒冷季节,在亚洲有研究表明GI.6暴发的时间主要在夏季,以食部分地区,新型GIL17是急性胃肠炎暴发的主要原源性传播为主,本研究检出的G1.6序列数量最因-,表明非G14可能成为引起急性胃肠炎暴多,占GI序列总数的568%,且全年各月均有检出。发的主要基因型。本研究检出GI.17序列106条考虑本研究中的高检出率和当地无相关疫情报道占GH序列总数的59.6%,远多于GIl4毒株,是GIl 的情况,认为目前在监测地区GI.6以散发形式常年的主要基因型,与上述研究中主要引起胃肠炎暴发存在。GI.6在所有报道的NoV疫情暴发中占相对的NoV基因型一致。山东省于2014年首次检出属较小的比例,但在本研究中G1.6的检出并不少见,于 Kawasaki308变异株的序列,至2016年山东省因此对GL.6的监测和防控仍应受到重视。检出的GI.17序列全部属于 Kawasaki308变异株, 自1995年以来,世界上由NoV导致的胃肠炎提示该变异株自进入本区域以来在人群中持续传中约0%由GI4引起l-1,至少有9种GI4变异播,逐步建立起区域性循环,而导致以往大流行的株在全球流行,其中有6种变异株与NoⅤ相关的胃GI.4分离株检出率极低,说明人群中流行的主要毒肠炎大流行有关。 Sydeny2012变异株仍是世界株随着时间的推移而发生改变。研究结果提示了上主要的GⅡ.4变异株。本研究在两个监测地各检持续监测的重要性。系统进化分析显示,GI17部出2条GⅡl4序列全部属于 Sydeny2012变异株,表分序列与珠海、江苏腹泻暴发的NoV变异株具有较明 Sydeny2012变异株仍然是山东监测地区GI4的高的亲缘关系,说明监测污水中的病毒具有重要的优势毒株,且检出月份为冬季,符合NoV寒冷季节公共卫生意义。流行的特点。由于NoV变异速度快,且易导致急性胃肠炎暴临沂市GI.3序列(LY540—2)与广东参考序列发,在肠道中复制的病毒可随粪便排出体外,进入 (KY407194)核苷酸同源性为100%,且分离时间均城市生活污水,且在污水环境中能长时间保持稳

刘姗姗，等 . 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究核苷酸同源性分析表明，同一地区同一时间获取的毒株序列、不同地区间或不同时间内获取的毒株序列的型内核苷酸同源性都可以达到 100%，这表明一些传播链在人群中存在时空与地域的连续循环。有研究表明 GI.6 暴发的时间主要在夏季，以食源性传播为主［10］，本研究检出的 GI.6 序列数量最多，占 GI 序列总数的 56.8%，且全年各月均有检出。考虑本研究中的高检出率和当地无相关疫情报道的情况，认为目前在监测地区 GI.6 以散发形式常年存在。GI.6 在所有报道的 NoV 疫情暴发中占相对较小的比例，但在本研究中 GI.6 的检出并不少见，因此对 GI.6 的监测和防控仍应受到重视。自 1995 年以来，世界上由 NoV 导致的胃肠炎中约 70% 由 GII.4 引起［11-13］，至少有 9 种 GII.4 变异株在全球流行，其中有 6 种变异株与 NoV 相关的胃肠炎大流行有关［14］。Sydeny2012 变异株仍是世界上主要的 GII.4 变异株。本研究在两个监测地各检出 2 条 GII.4 序列全部属于 Sydeny2012 变异株，表明 Sydeny2012 变异株仍然是山东监测地区 GII.4 的优势毒株，且检出月份为冬季，符合 NoV 寒冷季节流行的特点。临沂市 GII.3 序列（LY540-2）与广东参考序列（KY407194）核苷酸同源性为 100%，且分离时间均为 2016 年，表明两者之间可能存在远距离传播。此前已有研究表明，将生活污水里的 NoV 与世界各地分离株进行核苷酸同源性比较和系统发生学分析，有助于明确 NoV 的传播路径，追踪起源［15］。有研究报道，2014~2015 年寒冷季节，在亚洲部分地区，新型 GII.17 是急性胃肠炎暴发的主要原因［16-18］，表明非 GII.4 可能成为引起急性胃肠炎暴发的主要基因型。本研究检出 GII.17 序列 106 条，占 GII 序列总数的 59.6%，远多于 GII.4 毒株，是 GII 的主要基因型，与上述研究中主要引起胃肠炎暴发的 NoV 基因型一致。山东省于 2014 年首次检出属于 Kawasaki 308 变异株的序列［19］，至 2016 年山东省检出的 GII.17 序列全部属于 Kawasaki 308 变异株，提示该变异株自进入本区域以来在人群中持续传播，逐步建立起区域性循环，而导致以往大流行的 GII.4 分离株检出率极低，说明人群中流行的主要毒株随着时间的推移而发生改变。研究结果提示了持续监测的重要性。系统进化分析显示，GII.17 部分序列与珠海、江苏腹泻暴发的 NoV 变异株具有较高的亲缘关系，说明监测污水中的病毒具有重要的公共卫生意义。由于 NoV 变异速度快，且易导致急性胃肠炎暴发，在肠道中复制的病毒可随粪便排出体外，进入城市生活污水，且在污水环境中能长时间保持稳 Notes：Phylogenetic relationship of Shandong and other sequence. GI.6，GII.3 and GII.17 are illustrated in a to c respectively. ● Isolates from sewage；□ reference sequence 图 1 GI.6、GII.3 和 GII.17 系统进化树 Figure 1 Phylogenetic trees of GI.6，GII.3 and GII.17 sequences · 5 ·

病毒学报定。本研究从时空和地域两个层面再次揭示了城[6] Kojima s, Kageyama T, Fukushi s, Hoshino F b,Shir 市生活污水中NoV的广泛存在及其分子流行病学 nohara M, Uchida K. Natori K, Takeda N, Katayama 特征,且揭示了NoV多种基因型共循环特征。 K. Genogroup ific PCR primers for detection of NoV感染通常以隐性和轻型感染为主,且呈自 Norwalk-like viruses [J]. J Virol Methods, 2002. 100 (1-2):107-114 限性,主动就医较少,目前尚无当地足够的病例资 [7] Wang H, Wang Q, Zhao J, Tu C. Mo Q. Lin J, Yang 料,因此不能将生活污水的检测结果与当地感染情 Z Complete nucleotide sequence analysis of the norovi- 况对照分析。但从生活污水中监测的病毒水平可 rus Gll. 17: A newly emerging and dominant variant in 间接反映人群中NoV的循环情况,环境监测的数据 China, 2015 [J]. Infect Genet Evol, 2016, 38(1) 可以作为病例监测的有效补充,尤其在当前病毒性 47-53 腹泻监测强度和监测数据比较薄弱的情况下,环境[8] Fu J. Ai J·JimM. Jiang C· Zhang J,ShC.LinQ 监测可以提供有力的数据。借助分子生物学方法 Yuan Z, QiX, Bao C, Tang F, Zhu Y Emergence of a 的污水监测具有高效、省时省力的优点,是监测人 new GIl. 17 norovirus variant in patients with acute g 群中NoV流行情况的有效方法。本研究的数据对 troenteritis in Jiangsu, China, September 2014 to March 015[J. Euro surveill.2015,20(24):21157 于掌握当地人群中NoV的循环状况有极为重要的 [9]邓丽丽,刘巍,马宇燕,谭冬梅,梁亮,韦敬航,钟革南实际意义。宁市朝阳溪污水中诺如病毒检测及其基因型分布[J] 目前可感染人类的NoV有GI、GI和GIV,由中国热带医学,2017,17(04):358-361. 于GI和GI是引起人类急性胃肠炎病毒的主要基[10] Leshem e. Barclay I, Wikswo m, Vega E, Gregori 因型,因此本研究只分析了GI和GIl,未对GIV进 cus N, Parashar U D, Vinje J, Hall A J Genotype G1. 6 行探索,为了更全面掌握本地NoV的流行情况,我 United States, 2010-2012[J]. Em Infect D 们今后也将GIV纳入监测范围 013,19(8):1317-1320 [11] Siebenga J J, Lemey P, Pond S, Rambaut A 参考文献 Vennema H Phy lodynamic reconstruction reveals norovi- rus Gll. 4 epidemic expansions and their molecular deter [1] Kapikian A Z, Wyatt R G, Dolin R. Thornhill TS,Ka minants[J]. PLoS Pathoq. 2010. 6(5): e1000884 lica A R, Chanock R M. Visualization by immune elec- [12]Lopman B, Vennema H, Kohli E, Pothier P, Sanchez tron microscopy of a 27-nm particle associated with A. Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe acute infectious nonbacterial gastroenteritis [J]. J Virol and epidemic spread of new norovirus variant. [J].Lan 1972,10:1075-1081 cet,2004,363(9410):682-688 [2] Lopman B A, Steele D, Kirkwood C D, Parashar U D [13]van Beek J, Amber-Balay K, Botteldoom N, Eden J The vast and varied global burden of norovirus: pros- S, Fonager J. Hewitt J, Iritani N, Kroneman A cts for prevention and control[J]. Plos Med, 2016, 13 Vennema H. Vinje J, White P A. Koopmans M, No- (4):e1001999 roNetIndications for worldwide increased norovirus ac- [3 Ao Y. Wang J, Ling H,He tivity associated with emergence of a new variant of gen Duan Z Norovirus Gll. P16/ otype 11.4, late 2012[J]. Euro Surveill, 2013, 18(1) GIL 2-associated gastroenteritis, China, 2016[J]. Em Infect D,2017.23(7):1172-1175 [14] Dai Y C, Zhang X F, Xia M, Tan M, Quigley C, Lei [4] Lodder W J. Vinje J, Van D, Roda H A M, Leenen E W, Fang H, Zhong W, Lee B, Pang X, Nie J, Jiang X J M, Koopmans M P G Molecular detection of No Antigenic relatedness of norovirus GIl. 4 variants deter- walk-like caliciviruses in sewage[J]. Appl Environ Mi- mined by human challenge sera [J/OL]. PloS One 2015,10(4):e0124945 [5] IwaI M, Hasegawa S, Obara m, Nakamura K, Horno-[15]王培,陶泽新,王素婷,周楠,林小娟,王海岩,宋立志 to E, Takizawa T, Kurata T, Sogen S, Shiraki K Con 徐爱强.环境污水中诺如、轮状、星状病毒的检测和分 tinuous presence of noroviruses and sapoviruses in raw 子流行病学研究[J].病毒学报,2016,32(04) sewage reflects infections among inhabitants of Toya 478-483 ma, Japan(2006 to 2008)[J]. Appl Environ Microbiol. [16] Jin M, Zhou Y K. Xie H P, Fu J G, He Y Q, Zhang 2009,75(5):1264-1270 S, Jing H B, Kong X Y, Sun X M, Li H Y. Zhang Q

病毒学报定。本研究从时空和地域两个层面再次揭示了城市生活污水中 NoV 的广泛存在及其分子流行病学特征，且揭示了 NoV 多种基因型共循环特征。 NoV 感染通常以隐性和轻型感染为主，且呈自限性，主动就医较少，目前尚无当地足够的病例资料，因此不能将生活污水的检测结果与当地感染情况对照分析。但从生活污水中监测的病毒水平可间接反映人群中 NoV 的循环情况，环境监测的数据可以作为病例监测的有效补充，尤其在当前病毒性腹泻监测强度和监测数据比较薄弱的情况下，环境监测可以提供有力的数据。借助分子生物学方法的污水监测具有高效、省时省力的优点，是监测人群中 NoV 流行情况的有效方法。本研究的数据对于掌握当地人群中 NoV 的循环状况有极为重要的实际意义。目前可感染人类的 NoV 有 GI、GII 和 GIV，由于 GI 和 GII 是引起人类急性胃肠炎病毒的主要基因型，因此本研究只分析了 GI 和 GII，未对 GIV 进行探索，为了更全面掌握本地 NoV 的流行情况，我们今后也将 GIV 纳入监测范围。参考文献：［1］ Kapikian A Z，Wyatt R G，Dolin R，Thornhill T S，Ka⁃ lica A R，Chanock R M.Visualization by immune elec⁃ tron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis［J］. J Virol， 1972，10：1075-1081. ［2］ Lopman B A，Steele D，Kirkwood C D，Parashar U D. The vast and varied global burden of norovirus：pros⁃ pects for prevention and control［J］. Plos Med，2016，13 （4）：e1001999. ［3］ Ao Y，Wang J，Ling H，He Y，Dong X，Wang X， Peng J，Zhang H，Jin M，Duan Z.Norovirus GII.P16 / GII. 2 – associated gastroenteritis，China，2016［J］. Em Infect D，2017，23（7）：1172-1175. ［4］ Lodder W J，Vinjé J，Van D，Roda H A M，Leenen E J T M，Koopmans M P G.Molecular detection of Nor⁃ walk-like caliciviruses in sewage［J］. Appl Environ Mi⁃ crobiol，1999，65（12）：5624-5627. ［5］ Iwai M，Hasegawa S，Obara M，Nakamura K，Horimo⁃ to E，Takizawa T，Kurata T，Sogen S，Shiraki K.Con⁃ tinuous presence of noroviruses and sapoviruses in raw sewage reflects infections among inhabitants of Toya⁃ ma，Japan（2006 to 2008）［J］. Appl Environ Microbiol， 2009，75（5）：1264-1270. ［6］ Kojima S，Kageyama T，Fukushi S，Hoshino F B，Shi⁃ nohara M，Uchida K，Natori K，Takeda N，Katayama K. Genogroup - specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses［J］. J Virol Methods，2002，100 （1-2）：107-114. ［7］ Wang H，Wang Q，Zhao J，Tu C，Mo Q，Lin J，Yang Z. Complete nucleotide sequence analysis of the norovi⁃ rus GII. 17：A newly emerging and dominant variant in China，2015［J］. Infect Genet Evol，2016，38（1）： 47-53. ［8］ Fu J，Ai J，Jin M，Jiang C，Zhang J，Shi C，Lin Q， Yuan Z，Qi X，Bao C，Tang F，Zhu Y.Emergence of a new GII.17 norovirus variant in patients with acute gas⁃ troenteritis in Jiangsu，China，September 2014 to March 2015［J］. Euro Surveill，2015，20（24）：21157. ［9］邓丽丽，刘巍，马宇燕，谭冬梅，梁亮，韦敬航，钟革 . 南宁市朝阳溪污水中诺如病毒检测及其基因型分布［J］. 中国热带医学，2017，17（04）：358-361. ［10］Leshem E，Barclay L，Wikswo M，Vega E，Gregori⁃ cus N，Parashar U D，Vinjé J，Hall A J.Genotype GI.6 norovirus，United States，2010–2012［J］. Em Infect D， 2013，19（8）：1317-1320. ［11］Siebenga J J， Lemey P， Pond S， Rambaut A， Vennema H.Phylodynamic reconstruction reveals norovi⁃ rus GII.4 epidemic expansions and their molecular deter⁃ minants［J］. PLoS Pathoq，2010，6（5）：e1000884. ［12］Lopman B，Vennema H，Kohli E，Pothier P，Sanchez A. Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe and epidemic spread of new norovirus variant.［J］. Lan⁃ cet，2004，363（9410）：682-688 ［13］van Beek J，Amber-Balay K，Botteldoom N，Eden J S， Fonager J， Hewitt J， Iritani N， Kroneman A， Vennema H，Vinjé J，White P A，Koopmans M，No⁃ roNet.Indications for worldwide increased norovirus ac⁃ tivity associated with emergence of a new variant of gen⁃ otype II. 4，late 2012［J］. Euro Surveill，2013，18（1）： 8-9. ［14］Dai Y C，Zhang X F，Xia M，Tan M，Quigley C，Lei W，Fang H，Zhong W，Lee B，Pang X，Nie J，Jiang X. Antigenic relatedness of norovirus GII. 4 variants deter⁃ mined by human challenge sera［J / OL］. PloS One， 2015，10（4）：e0124945. ［15］王培，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，王海岩，宋立志，徐爱强 . 环境污水中诺如、轮状、星状病毒的检测和分子流行病学研究［J］. 病毒学报，2016，32（04）： 478-483. ［16］Jin M，Zhou Y K，Xie H P，Fu J G，He Y Q，Zhang S，Jing H B，Kong X Y，Sun X M，Li H Y，Zhang Q， · 6 ·

刘姗姗,等.基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 Li K, Zhang Y J, Zhou D Q, Xing W J, Liao Q H, Liu [18] Chan M, Nelson L, Tin-Nok H, Kwok K, Cheung N, YuHJ, Jiang X, Tan M, Duan Z J Characterization K, Tin E, Lai R, Nelson E, Leung T, Chan P Rapid of the new Gll. 17 norovirus variant that emerged recent- mergence and predominance of a broadly recognizing ly as the predominant strain in China [J]. J Gen Virol d fast-evolving norovirus Gll. 17 variant in late 2014 2016,97,2620-2632. [J]. Nat Commun, 2015, 6: 100 [17]Lu J, Sun L, Fang L, Yang F, Mo Y, Lao J, Zheng [19] Zhou N, Lin X, Wang S, Tao Z, Xiong P, Liu Y H. Tan x. Lin h. rutherford s, guo l. ke c. hui la Song Y, Xu A Molecular epidemiology of GI and GIl Gastroenteritis outbreaks caused by norovirus GIl. 17 noroviruses in sewage: 1-year surveillance in eastern Guangdong Province, China, 2014-2015[J]. Em Infect J Appl Microbiol, 2016, 121(4) 1172 D,2015,21(7):1240-1242 1179 Norovirus Molecular Epidemiology based on Environmental Sewage Surveil lance LIU Shanshan, TAO Zexin, WANG Suting, ZHOU Nan, LIN Xiaojuan", SONG Yanyan (1. School of Public Health, Shandong University, Jinan 250012, China: 2. Shandong Cente ol and Prevention: Academy of Preventive Medicine, Shandong University, Shandong Provincial Key Laboratory of Infectious Disease Control and Prevention Jinan 250014. China) Abstract: To understand the detection, genotype distribution and molecular epidemiological characteristics of the Norovirus(Nov)in domestic sewage, and further explore the need for environmental surveillance tech niques to study regional epidemics of viral gastroenteritis, we collected sewage in Jinan and Linyi of Shandong province from January to December in 2016. 24 sewage samples were concentrated by anion membrane adsorp tion-elution method, the viral RNA was extracted, and the Nov VPI gene fragment were amplified by RT PCR. After TA-cloning and sequencing, the obtained sequences were subjected to genotyping and phylogenet ic analysis. The results showed the detection rate for NoV GI and GIl in the sewage samples were both 100% We obtained 412 Nov sequences totally, which belonged to 6 GI genotypes and 8 Gl genotypes. GI. 6 (32.3%,133/142),GIl. 3(14.1%,58/412)and GIL. 17(25.7%,106/412)were the most frequently detected GIl. 17 detection sequences all belonged to the Kawasaki 308 variant. GIl. 4 sequences, which caused pande in previous years, occupied for only 1.0% of total detection, and belonged to Sydney 2012 variant. This stud describes the genotype distribution and sequence characteristics of local NoV in Shandong province and proves Key words: Norovirus; Acute gastroenteritis; Molecular epidemiology; Environmental surveillance swage hat the genetic diversity of Nov in the population can be explored through the monitoring of urban Fanding: The present work was supported by Taishan Scholar Program of Shandong Province(ts 201511105), the National Natural Science Foundation of China(81573209)and the Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2014HM076) *CorrespondingauthorSongYanyan,E-mail:yysong@sduedu.cn;XuAigiang.E-mail;aqruepi@163.com

刘姗姗，等 . 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 Li K，Zhang Y J，Zhou D Q，Xing W J，Liao Q H，Liu N，Yu H J，Jiang X，Tan M，Duan Z J.Characterization of the new GII.17 norovirus variant that emerged recent⁃ ly as the predominant strain in China［J］. J Gen Virol， 2016，97，2620-2632. ［17］Lu J，Sun L，Fang L，Yang F，Mo Y，Lao J，Zheng H，Tan X，Lin H，Rutherford S，Guo L，Ke C，Hui L. Gastroenteritis outbreaks caused by norovirus GII. 17， Guangdong Province，China，2014–2015［J］. Em Infect D，2015，21（7）：1240-1242. ［18］Chan M，Nelson L，Tin-Nok H，Kwok K，Cheung K，Tin E，Lai R，Nelson E，Leung T，Chan P.Rapid emergence and predominance of a broadly recognizing and fast-evolving norovirus GII.17 variant in late 2014 ［J］. Nat Commun，2015，6：10061. ［19］Zhou N，Lin X，Wang S，Tao Z，Xiong P，Liu Y， Song Y，Xu A. Molecular epidemiology of GI and GII noroviruses in sewage：1-year surveillance in eastern China［J］. J Appl Microbiol，2016，121（4）：1172- 1179. Norovirus Molecular Epidemiology Based on Environmental Sewage Surveil⁃ lance LIU Shanshan1 ，TAO Zexin2 ，WANG Suting2 ，ZHOU Nan1 ，LIN Xiaojuan2 ，SONG Yanyan1* ， XU Aiqiang1,2* （1. School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China；2. Shandong Center for Disease Control and Prevention；Academy of Preventive Medicine，Shandong University，Shandong Provincial Key Laboratory of Infectious Disease Control and Prevention， Jinan 250014，China） Abstract：To understand the detection，genotype distribution and molecular epidemiological characteristics of the Norovirus（NoV）in domestic sewage，and further explore the need for environmental surveillance tech⁃ niques to study regional epidemics of viral gastroenteritis，we collected sewage in Jinan and Linyi of Shandong province from January to December in 2016. 24 sewage samples were concentrated by anion membrane adsorp⁃ tion-elution method，the viral RNA was extracted，and the NoV VP1 gene fragment were amplified by RTPCR. After TA-cloning and sequencing，the obtained sequences were subjected to genotyping and phylogenet⁃ ic analysis. The results showed the detection rate for NoV GI and GII in the sewage samples were both 100%. We obtained 412 NoV sequences totally，which belonged to 6 GI genotypes and 8 GII genotypes. GI. 6 （32.3%，133/142），GII.3（14.1%，58/412）and GII.17（25.7%，106/412）were the most frequently detected. GII.17 detection sequences all belonged to the Kawasaki 308 variant. GII.4 sequences，which caused pandemic in previous years，occupied for only 1.0% of total detection，and belonged to Sydney 2012 variant. This study describes the genotype distribution and sequence characteristics of local NoV in Shandong province and proves that the genetic diversity of NoV in the population can be explored through the monitoring of urban sewage. Key words：Norovirus；Acute gastroenteritis；Molecular epidemiology；Environmental surveillance Funding：The present work was supported by Taishan Scholar Program of Shandong Province（ts. 201511105），the National Natural Science Foundation of China（81573209）and the Natural Science Foundation of Shandong Province（ZR2014HM076）. ∗ Corresponding author ：SONG Yanyan，E-mail：yysong@sdu.edu.cn；XU Aiqiang，E-mail：aqxuepi@163.com · 7 ·

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