贵州医科大学学报 41卷 养皿中,用灭菌的涂布器涂匀,倒置于37℃恒温培液以10为倍数进行病毒梯度稀释,选取所需的细 养箱内过夜培养。挑取单菌落,进行小量摇菌培胞孔,吸去培养基90μL,取90μL慢病毒稀释液 养。测序鉴定阳性克隆。 加入每孔细胞中,放入37℃的细胞培养箱中培养。 1.2.3慢病毒包装将293T细胞置于含10%24h后去除含慢病毒的培养基,加入完全培养基 FBS的1640培养基的10cm培养皿中生长,当细100μL,48h后在荧光显微镜下观察各孔中表达绿 胞长到π0%~80%时细胞换无血清培养基培养1色荧光蛋白的细胞数量,病毒滴度为表达荧光的细 2h后转染。取无菌1.5mLEP管,加入DMEM胞数x稀释倍数 培养基1mL、 shRNA10μg、 Lenti-HG Mⅸx10μL和 HG transgene reagent60μ,混匀后,室温放置15-2结果 20min后均匀滴加到提前换过液的培养皿中共转 染。共转染10~12h时,均匀滴加100× Enhan2.1 PGMLV- SCSRNAI慢病毒载体构建及鉴定 ng buffer(120μL/平皿)促进转染。共转染18 构建的 PGMLV-SC5RNAi慢病毒载体如图1。 20h时换液,48h后,吸取细胞上清液于50mL离心图2B中的泳道4为 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体 管,4℃,4500r/min离心5min;上清液用0.45 um DNA经过BamH和 EcoRI酶切后,形成线性的 滤器过滤后转移到新的离心管中,最后将滤液分批DNA分子;而泳道2和3均为未酶切的质粒DNA 转移到浓缩装置中,4℃,4500r/min离心l0min,可见环形和超螺旋的质粒DNA条带,泳道1、5为 此时滤器上层的液体即为病毒浓缩液。将病毒浓标准分子量参照物( marker),电泳结果验证所提取 缩液以50μL/管进行分装,-80℃保存备用。 的DNA为 PGMLV-SC5RNAi慢病毒载体DNA。 1.2.4病毒滴度的测定将HEK293T细胞培养测序结果经过 BLAST软件比对,重组克隆中插入 至对数生长期,细胞胰酶消化计数,按照8000细的序列与设计合成的4对 shRNA及1对阴性对 胞/孔接种96孔板,37℃培养过夜;细胞长至30%照 oligo dna完全一致(图2),慢病毒载体构建 50%时进行转染,用含有10%FBS的细胞培养成功。 4000bp eGFF 1000bp 250 100bp 3 LTR 注:A为 PGMLV-SCSRNAi慢病毒载体模式,B为电泳结果 图1pGMLⅤ- SCI RNAI慢病毒载体模式及电泳结果 ig. 1 Map of pGMLV-SCl RNAi lentiviral vector 2.2慢病毒载体的包装及滴度测定 hnRNA2/B1- shRNA、 shRNA2、 shRNA3、shR-3讨论 NA4及NC- shRNA病毒感染HEK293T细胞,荧光 显微镜下可见细胞生长良好,细胞内可见强的绿色 RNA干扰( RNA interference,RNAi)是导入一 荧光(图4),说明慢病毒载体包装成功,在含有10条RNA序列,此序列与目的基因的mRNA序列同 ×10-个/L细胞浓度的慢病毒液孔中观察到表达源,因此可以将目的基因的mRNA有效的特异降 绿色荧光蛋白的细胞数均>50。病毒的滴度为5解,使目的基因失去应有的功能。目前,RNA 10TU/L。 干扰的方法最常用的是直接转染 SiRNA和构建 632养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于 ３７℃恒温培 养箱内过夜培养。挑取单菌落，进行小量摇菌培 养。测序鉴定阳性克隆。 １．２．３ 慢病毒包装 将 ２９３Ｔ细胞置于含 １０％ ＦＢＳ的 １６４０培养基的 １０ｃｍ培养皿中生长，当细 胞长到 ７０％ ～８０％时细胞换无血清培养基培养 １ ～２ｈ后转染。取无菌 １５ｍＬＥＰ管，加入 ＤＭＥＭ 培养基１ｍＬ、ｓｈＲＮＡ１０μｇ、ＬｅｎｔｉＨＧＭｉｘ１０μＬ和 ＨＧｔｒａｎｓｇｅｎｅｒｅａｇｅｎｔ６０μＬ，混匀后，室温放置 １５～ ２０ｍｉｎ后均匀滴加到提前换过液的培养皿中共转 染。共转染 １０～１２ｈ时，均匀滴加 １００×Ｅｎｈａｎ ｃｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（１２０μＬ／平皿）促进转染。共转染 １８～ ２０ｈ时换液，４８ｈ后，吸取细胞上清液于５０ｍＬ离心 管，４℃，４５００ｒ／ｍｉｎ离心 ５ｍｉｎ；上清液用 ０４５μｍ 滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批 转移到浓缩装置中，４℃，４５００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ， 此时滤器上层的液体即为病毒浓缩液。将病毒浓 缩液以 ５０μＬ／管进行分装，－８０℃保存备用。 １．２．４ 病毒滴度的测定 将 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养 至对数生长期，细胞胰酶消化计数，按照 ８０００细 胞／孔接种 ９６孔板，３７℃培养过夜；细胞长至 ３０％ ～５０％时进行转染，用含有 １０％ ＦＢＳ的细胞培养 液以 １０为倍数进行病毒梯度稀释，选取所需的细 胞孔，吸去培养基 ９０μＬ，取 ９０μＬ慢病毒稀释液 加入每孔细胞中，放入 ３７℃的细胞培养箱中培养。 ２４ｈ后去除含慢病毒的培养基，加入完全培养基 １００μＬ，４８ｈ后在荧光显微镜下观察各孔中表达绿 色荧光蛋白的细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细 胞数 ×稀释倍数。 ２ 结果 ２．１ ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体构建及鉴定 构建的 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体如图 １。 图 ２Ｂ中的泳道 ４为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体 ＤＮＡ经过 ＢａｍＨＩ和 ＥｃｏＲＩ酶切后，形成线性的 ＤＮＡ分子；而泳道 ２和 ３均为未酶切的质粒 ＤＮＡ， 可见环形和超螺旋的质粒 ＤＮＡ条带，泳道 １、５为 标准分子量参照物（ｍａｒｋｅｒ），电泳结果验证所提取 的 ＤＮＡ 为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢 病 毒 载 体 ＤＮＡ。 测序结果经过 ＢＬＡＳＴ软件比对，重组克隆中插入 的序列与设计合成的 ４对 ｓｈＲＮＡ及 １对阴性对 照 ｏｌｉｇｏＤＮＡ完全一致（图 ２），慢病毒载体构建 成功。 注：Ａ为 ｐＧＭＬＶＳＣ５ＲＮＡｉ慢病毒载体模式，Ｂ为电泳结果 图 １ ｐＧＭＬＶＳＣ１ＲＮＡｉ慢病毒载体模式及电泳结果 Ｆｉｇ．１ ＭａｐｏｆｐＧＭＬＶ－ＳＣ１ＲＮＡｉｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ ２．２ 慢病毒载体的包装及滴度测定 ｈｎＲＮＰＡ２／Ｂ１ｓｈＲＮＡ１、ｓｈＲＮＡ２、ｓｈＲＮＡ３、ｓｈＲ ＮＡ４及 ＮＣｓｈＲＮＡ病毒感染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，荧光 显微镜下可见细胞生长良好，细胞内可见强的绿色 荧光（图 ４），说明慢病毒载体包装成功，在含有 １０ ×１０－５个／Ｌ细胞浓度的慢病毒液孔中观察到表达 绿色荧光蛋白的细胞数均 ＞５０。病毒的滴度为 ５ ×１０１１ＴＵ／Ｌ。 ３ 讨论 ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是导入一 条 ＲＮＡ序列，此序列与目的基因的 ｍＲＮＡ序列同 源，因此可以将目的基因的 ｍＲＮＡ有效的特异降 解，使目的基因失去应有的功能［４］ 。目前，ＲＮＡ 干扰的方法最常用的是直接转染ｓｉＲＮＡ和构建 ２３６ 贵 州 医 科 大 学 学 报 ４１卷