分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 一.实验目的： 1.用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数K,和最大反应速率vm。 2.了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 3.掌握分光光度计的使用方法 二，实验原理： 酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物 催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。 在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时， 总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率 反应速率最大 Michaelis应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应 速率和底物浓度的关系： V·C V= 米氏常数K,是反应速常达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应 速率，为了准确求得K,,用双倒数作图法，可由直线方程： 1=K.1+1 V V'mx C:Vma 以为级坐标专为生标作国，所得直线的酸面是。 ,斜率是K,直线与 横坐标的交点为一 1 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以 用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系 因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所 以测量不同底物（蔗糖）浓度C,的相应反应速*y,就可用作图法计算出米氏常数K,值。 三.仪器与试剂： :分光光度计一台：恒温水浴一套：比色管25mD9支：称液管(1m》 0支称液管（2ml4支：试管(10m)10支 硝基水杨酸试剂（即DNS):0.1mol,dm 醋酸缓冲溶液：蔗糖酶溶液：蔗糖（分析纯）：葡萄糖（分析纯）。 四.实验步骤： 分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 一．实验目的： 1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 KM 和最大反应速率 max v 。 2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 3. 掌握分光光度计的使用方法 二．实验原理： 酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物 催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。 在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时， 总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率， 反应速率最大。 Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应 速率和底物浓度的关系： M s s K c v c v +  = max 米氏常数 KM 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应 速率，为了准确求得 KM ，用双倒数作图法，可由直线方程： max max 1 1 1 v c v K v s M =  + 以 v 1 为纵坐标， s c 1 为横坐标，作图，所得直线的截距是 max 1 v ，斜率是 max v K M ，直线与 横坐标的交点为 K M 1 − 。 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以 用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与 3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系， 因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所 以测量不同底物（蔗糖）浓度 s c 的相应反应速率 v ，就可用作图法计算出米氏常数 KM 值。 三．仪器与试剂： 高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml）9 支；称液管（1ml） 10 支；称液管（2ml）4 支；试管（10ml）10 支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即 DNS）；0.1mol.dm-3 醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。 四．实验步骤：