分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 一.实验目的： 1.用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数K,和最大反应速率vm。 2.了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 3.掌握分光光度计的使用方法 二，实验原理： 酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物 催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。 在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时， 总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率 反应速率最大 Michaelis应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应 速率和底物浓度的关系： V·C V= 米氏常数K,是反应速常达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应 速率，为了准确求得K,,用双倒数作图法，可由直线方程： 1=K.1+1 V V'mx C:Vma 以为级坐标专为生标作国，所得直线的酸面是。 ,斜率是K,直线与 横坐标的交点为一 1 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以 用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系 因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所 以测量不同底物（蔗糖）浓度C,的相应反应速*y,就可用作图法计算出米氏常数K,值。 三.仪器与试剂： :分光光度计一台：恒温水浴一套：比色管25mD9支：称液管(1m》 0支称液管（2ml4支：试管(10m)10支 硝基水杨酸试剂（即DNS):0.1mol,dm 醋酸缓冲溶液：蔗糖酶溶液：蔗糖（分析纯）：葡萄糖（分析纯）。 四.实验步骤：
分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 一．实验目的： 1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数 KM 和最大反应速率 max v 。 2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系 3. 掌握分光光度计的使用方法 二．实验原理： 酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物 催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。 在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时， 总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率， 反应速率最大。 Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应 速率和底物浓度的关系： M s s K c v c v + = max 米氏常数 KM 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应 速率，为了准确求得 KM ，用双倒数作图法，可由直线方程： max max 1 1 1 v c v K v s M = + 以 v 1 为纵坐标， s c 1 为横坐标，作图，所得直线的截距是 max 1 v ，斜率是 max v K M ，直线与 横坐标的交点为 K M 1 − 。 本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以 用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与 3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色 的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系， 因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所 以测量不同底物（蔗糖）浓度 s c 的相应反应速率 v ，就可用作图法计算出米氏常数 KM 值。 三．仪器与试剂： 高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml）9 支；称液管（1ml） 10 支；称液管（2ml）4 支；试管（10ml）10 支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即 DNS）；0.1mol.dm-3 醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。 四．实验步骤：
1,蔗糖酶的制取.在50ml的锥形瓶中加入鲜酵母10g,加入0.8g醋酸钠，搅拌15.20min 后使块团溶化，加入15m甲苯，用软木塞将瓶口塞住，摇动10mim,放入37℃的 恒温箱中保温60h。取出后加入16ml的4molM的醋酸和5ml水，使PH为45左 右。混合物以每分钟3000转的离心机离心杜小时，混合物形成三层，将中层移出 注入试管中，为粗制酶液。 2,溶液的配制。 (1)0.1%葡萄糖标准液(1mgmL):先在90℃下将葡萄糖烘1h,然后准确称取 1g于100ml烧杯中 用少量蒸馏水溶解后，定量移至1000ml容量瓶中 (2)3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS):6.3gDNS和262ml的2mo/LNaOH加到酒 石酸钾钠的热溶液中(182g酒石酸钾钠溶于500ml水中)，再加5g重蒸酚和5g 亚硫酸钠，微热搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000ml,贮于棕色瓶中备用。 (3)01m0l1的萨轴液：准确称取342g旅糖溶解后定容至1000容量瓶中。 3.葡萄糖 示准曲线的制作。 在9个50ml的容量瓶中，加入不同量Q.1%葡萄糖标准液 及蒸馏水，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液。分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液 1.0ml注入9支试管内，另取一支试管加入1.0ml蒸馏水，然后在每支试管中加入 1.5 mlDNS试剂，混合均匀，在沸水浴中加热5min后，取出以冷水冷却，每支内 注入蒸馏水2.5ml,摇匀。在分光光度计上用540m波长测定其吸光度。由测定结 果作出标准曲线。 4.蔗糖酶米氏常数K的测定。在9支试管中分别加入0.1moL燕糖液、醋酸缓 溶液，总体积达2ml,于35℃水浴中预热，另取预先制备的酶液在35℃水浴中保 温10min,依次向试管中加入稀释过的酶液各2.0ml,准确作用5min后，按次序加 入0.5ml2mo/L的NaOH溶液，摇匀，令酶反应中停止，测定时，从每支试管中 吸取0.5ml酶反应液加入装有1.5 mlDNS试剂的25ml比色管中， 加入蒸馏水 沸水中加热5min后冷却，用蒸馏水稀至刻度，摇匀，540mm波长测定其吸光度
１．蔗糖酶的制取。在50ml的锥形瓶中加入鲜酵母10g，加入0.8g醋酸钠，搅拌15-20min 后使块团溶化，加入 1.5ml 甲苯，用软木塞将瓶口塞住，摇动 10min，放入 37℃的 恒温箱中保温 60h。取出后加入 1.6ml 的 4mol/L 的醋酸和 5ml 水，使 PH 为 4.5 左 右。混合物以每分钟 3000 转的离心机离心灶小时，混合物形成三层，将中层移出， 注入试管中，为粗制酶液。 ２．溶液的配制。 （１）0.1%葡萄糖标准液（1mg/mL）：先在 90℃下将葡萄糖烘 1h，然后准确称取 1g 于 100ml 烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量移至 1000ml 容量瓶中。 （2）3,5-二硝基水杨酸试剂（即 DNS）：6.3gDNS 和 262ml 的 2mol/LNaOH 加到酒 石酸钾钠的热溶液中（182g 酒石酸钾钠溶于 500ml 水中），再加 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，微热搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到 1000ml，贮于棕色瓶中备用。 （3）0.1mol/L 的蔗糖液：准确称取 34.2g 蔗糖溶解后定容至 1000 容量瓶中。 ３．葡萄糖标准曲线的制作。在 9 个 50ml 的容量瓶中，加入不同量 0.1%葡萄糖标准液 及蒸馏水，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液。分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液 1.0ml 注入 9 支试管内，另取一支试管加入 1.0ml 蒸馏水，然后在每支试管中加入 1.5mlDNS 试剂，混合均匀，在沸水浴中加热 5min 后，取出以冷水冷却，每支内 注入蒸馏水 2.5ml，摇匀。在分光光度计上用 540nm 波长测定其吸光度。由测定结 果作出标准曲线。 ４．蔗糖酶米氏常数 KM 的测定。在９支试管中分别加入 0.1mol/L 蔗糖液、醋酸缓冲 溶液，总体积达 2ml，于 35℃水浴中预热，另取预先制备的酶液在 35℃水浴中保 温 10min，依次向试管中加入稀释过的酶液各 2.0ml，准确作用 5min 后，按次序加 入 0.5ml 2mol/L 的 NaOH 溶液，摇匀，令酶反应中停止，测定时，从每支试管中 吸取 0.5ml 酶反应液加入装有 1.5mlDNS 试剂的 25ml 比色管中，加入蒸馏水，在 沸水中加热 5min 后冷却，用蒸馏水稀至刻度，摇匀，540nm 波长测定其吸光度
SYC15 2006428 实验所需仪器设备 五.数据处理： 由各反应液测得的吸光度值，在葡萄糖标淮曲线上查出对应的葡萄糖浓度，结合反 应时间计算其反应速率,并将对应的底物（蔗糖）浓度C,一并用表格形式列出， 将对行作图。以直战斜率和距求出人和· 六。思考题 1·为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？为什么会产生过冷现象？ 2.试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系
实验所需仪器设备 五．数据处理： 由各反应液测得的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖浓度，结合反 应时间计算其反应速率 v ，并将对应的底物（蔗糖）浓度 s c ，一并用表格形式列出， 将 v 1 对 s c 1 作图，以直线斜率和截距求出 KM 和 max v 。 六．思考题 １．为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？为什么会产生过冷现象？ ２．试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系