双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以 完整地切下个别基因。自70年代以来,人们已经分离提取了400多种“分子剪刀” 有了形形色色的“分子剪刀”,人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。 DNA的分子链被切开后,还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年,科学们在5 个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶,这种酶可以将两个DNA片段连接起来 修复好DNA链的断裂口。1974年以后,科学界正式肯定了这一发现,并把这种酶 叫作DNA连接酶。从此,DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线” 只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”,就会把两种 DNA片段重新连接起来。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去,必须寻找 种分子小、能自由进出细胞,而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的 运载体。理想的运载体是质粒,因为质粒能自由进出细菌细胞,应当用“分子剪刀” 把它切开,再给它安装上一段外来的DNA片段后,它依然如故地能自我复制。有 了限制性内切酶、连接酶及运载体,进行基因工程就可以如愿以偿了。运载体将目 的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步,目的基因的导入过程是肉眼看不到的 因此,要知道导入是否成功,事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的 抗四环素质粒PSC100作载体,将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时,如果基 因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死,就说明转入获得成功了。 工程菌的获得 1,确定目的产物 2,找出产该产物的细胞 3,将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所 有蛋白质的合成信息。 4,利用基因扩增技术(PCR),找出所需的目的基因。 5,将目的基因连接到设计好的质粒载体,形成了重组DNA分子 6,将重组后DNA分子引入到受体细胞内,然后选择合适的培养条件使细胞繁 殖。根据选择性标记,从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌 工程菌应具备的条件 1,发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的,同时是分泌型菌株 2,菌株能利用常用的碳源,并可进行连续发酵。 3,菌株不是致病株,也不产内毒素 4,代谢控制容易进行。双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以 完整地切下个别基因。自 70 年代以来，人们已经分离提取了 400 多种“分子剪刀”。 有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行 DNA 分子长链的切割了。 DNA 的分子链被切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976 年，科学们在 5 个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个 DNA 片段连接起来， 修复好 DNA 链的断裂口。1974 年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶 叫作 DNA 连接酶。从此，DNA 连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。 只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种 DNA 碎片中加上“分子针线”，就会把两种 DNA 片段重新连接起来。把“拼接”好的 DNA 分子运送到受体细胞中去，必须寻找 一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的 DNA 片段后仍能照样复制的 运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞，应当用“分子剪刀” 把它切开，再给它安装上一段外来的 DNA 片段后，它依然如故地能自我复制。有 了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就可以如愿以偿了。运载体将目 的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步，目的基因的导入过程是肉眼看不到的。 因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的 抗四环素质粒 PSC100 作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基 因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。 二、工程菌的获得 1，确定目的产物。 2，找出产该产物的细胞。 3，将细胞破碎后提纯出全部信使 RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所 有蛋白质的合成信息。 4，利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。 5，将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组 DNA 分子。 6，将重组后 DNA 分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁 殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。 三、工程菌应具备的条件 1，发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 2，菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 3，菌株不是致病株，也不产内毒素。 4，代谢控制容易进行