生物化学:核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第14页共14页 注:化学合成法价格昂贵,且每次合成的片段长度受限。19831986年 Mullis 等建立的聚合酶链式反应(PCR技术):是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩 增技术,即无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合 成的寡聚核苷酸引物介导,通过DNA聚合酶酶促反应,快速体外扩增特异的DNA序 列,PCR技术中每轮循环包括变性、复性和延伸3个阶段。 2、取得基因载体 异源基因直接用于转化,效率通常很低,真核基因尤其如此。而且进入受体细 胞后极易被水解,极不稳定。为了使目的基因在受体细胞中增殖表达,一般需要适 当的运载工具将其带入细胞内,这种运载工具称为载体。常用的载体有质粒和噬菌 体。质粒是细菌和酵母中独立于染色体之外能自主进行复制的双链闭环DNA分子 噬菌体是细菌病毒,也能独立复制、稳定地遗传。 对载体的要求 ①有1-2个(少数)限制性内切酶切点 ②易于克隆 ③有选择性标记 ④能独立复制 ⑤拷贝数多,易分离 ①借助限制性酶切粘性末端 目的基因与基因载体体外重组 ②人工粘性末端 4、将重组DNA引入活细胞,在活细胞中生长扩大百万倍以上 ①转化:对受体细胞进行某些处理,例CaCl2处理大肠杆菌。 ②筛选、鉴定 ③增殖、表达 5、应用 三、基因工程的应用与前景(讨论)生物化学: 核酸的生物合成 山农大生物化学与分子生物学系 第 14 页 共 14 页 14 注：化学合成法价格昂贵，且每次合成的片段长度受限。1983—1986 年 Mullis 等建立的聚合酶链式反应（PCR 技术）：是一种体外模拟自然 DNA 复制过程的核酸扩 增技术，即无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条 DNA 链为模板，由一对人工合 成的寡聚核苷酸引物介导，通过 DNA 聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异的 DNA 序 列，PCR 技术中每轮循环包括变性、复性和延伸 3 个阶段。 2、取得基因载体 异源基因直接用于转化，效率通常很低，真核基因尤其如此。而且进入受体细 胞后极易被水解，极不稳定。为了使目的基因在受体细胞中增殖表达，一般需要适 当的运载工具将其带入细胞内，这种运载工具称为载体。常用的载体有质粒和噬菌 体。质粒是细菌和酵母中独立于染色体之外能自主进行复制的双链闭环 DNA 分子。 噬菌体是细菌病毒，也能独立复制、稳定地遗传。 对载体的要求： ①有 1－2 个（少数）限制性内切酶切点 ②易于克隆 ③有选择性标记 ④能独立复制 ⑤拷贝数多，易分离 ①借助限制性酶切粘性末端 3、目的基因与基因载体体外重组 ②人工粘性末端 4、将重组 DNA 引入活细胞，在活细胞中生长扩大百万倍以上 ①转化： 对受体细胞进行某些处理，例 CaCl2处理大肠杆菌。 ②筛选、鉴定 ③增殖、表达 5、应用 三、基因工程的应用与前景（讨论）