山东农业大学：《生物化学》课程教学资源（教案讲义）第九章核酸的生物合成中心法则.pdf_大学文库

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 4 页共 14 页 4 具有 5’→3’聚合活力，较弱，3’→5’外切活性。但无 5’→3’外切活性。 ③DNA 聚合酶 Ⅲ（寡聚酶）是催化大肠杆菌 DNA 复制的主酶全酶有 10 种亚基，含 Zn2+ β亚基大约把酶的核心夹于模板上，从而提高全酶的工作能力。 ④DNA 聚合酶 IV 和 V 与 DNA 的修复有关。（1999 鉴定） 2、引发酶和引发体所有 DNA 聚合 E 都只能在模板链指令下，在引物（通常为 RNA）3′－OH 端添加新核苷酸（延伸新链）功能，没有从头合成活力。引发酶合成一小段 RNA 引物（有游离的 3′－OH），作为 DNA 合成的引物。引发酶为一条单链多肽，单独存在时相当不活泼，只有与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物活性。 3、DNA 连接酶催化双链 DNA 中一条链上缺口的共价连接，形成 3ˊ，5ˊ－－磷酸二酯键。缺口上的 3′－OH，5ˊ－磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基，连接酶不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量，大肠杆菌 NAD+ ，真核细胞 ATP。 4、DNA 解螺旋酶 DNA 双螺旋在复制和修复中都必须解链，以便提供单链 DNA 模板。催化 DNA 双螺旋解链，都有依赖双链 DNA 的 ATPase 活性。水解 ATP 提供解链所需能量。 5、单链 DNA 结合蛋白 SSB 结合蛋白的作用： DNA 双螺旋经解螺旋酶解链形成的单链很快被 SSB 所覆盖。 ①保护单链 DNA 免遭核酸的降解，使单链 DNA 保持伸展态，以便作为模板。 ②降低 DNA 的 Tm，促进 DNA 解链。原核细胞 SSB 有协同效应，真核细胞无。协同效应：先结合到已存在的单链区，其后的 SSB 的结合能力可提高 103 倍，表现出协同效应。 ΠΙ → → → ⎯⎯ →⎯ ⎪⎭ ⎪ ⎬ ⎫ 低活性的核心或pol 形成 θ刺激ε的3' 5'外切活力 ε亚基有3' 5'外切活性 a亚基有5' 3'聚合活力

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 5 页共 14 页 5 6、拓扑异构 E 大肠杆菌（原核生物）DNA 为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形式，连环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的 DNA 分子，可因连环数不同而形成一系列拓扑异构体。引起拓扑异构反应的 E，亦称旋转酶。有两种类型：拓扑异构酶Ⅰ，松解螺旋，能切开一条 DNA 链在复制叉前面的一段 DNA 的一个磷酸二酯键，允许该 DNA 链绕着另一条完整的 DNA 链自由旋转，而后由拓扑异构酶重新形成磷酸二酯键。（不需 ATP，可切无 DNA 双螺旋中的一条链）拓扑异构酶Ⅱ（旋转 E）细菌环形 DNA 复制后，两个 DNA 分子是互锁的。该酶结合到一双链 DNA 环上，造成一暂时性的双链断裂，另一 DNA 环正好从这一断裂处穿过，然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。（引入负超螺旋，需 ATP，消除复制叉前进时产生的扭曲张力。在无 ATP 时，可松解负超螺旋。可同时切断 DNA 双链。）（三）原核生物 DNA 复制以四种 dNTP 为底物在 DNA 模板指令下，按碱基配对的原则，由 DNA 聚合酶催化，向 DNA 的 3′－OH 端添加核苷酸，以 5’→3’的方向合成与模板互补的新链。 1、复制的起始原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有一个复制子。（基因组能独立进行复制的单位）。真核生物：多个位点起始，多复制子。大肠杆菌复制起始点：oriC 终止点：ter 一些特殊的 Pr 可以识别并结合到复制起点，随即使 DNA 双螺旋局部解链，形成复制眼，在其两端的 DNA 的两股链呈丫字状，称为复制叉。分别向两侧进行复制，通常复制叉双向等速前进，某些质粒，病毒和细胞器 DNA 的复制可以单向或是不等速的或是先合成一条链后再合成另一条链。 ⎯DNA ⎯ → ⎯聚合⎯⎯E 2+ Mg n1dATP n2dGTP n3dCTP n4dTTP DNA + DNA+(n1+n2+n3+n4)PPi

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 6 页共 14 页 6 迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制。 2、DNA 链的合成与延伸（1）在引发的复制叉上，DNA 聚合酶Ⅲ组装形成，然后按照 DNA 模板链的指令，自 RNA 引物 3’-OH 末端依次添加新的脱氧核苷酸残基，新生成的 DNA 链按 5’→3’方向不断延伸，同时新链与模板链反向平行，碱基配对。（2）由于两条模板链反向平行，若以走向 3’→5’的亲代链为模板，子代链就能连续合成，称为前导链，若以走向 5’→3’的亲代链为模板时，DNA 聚合酶Ⅲ只能按 5’ →3’的方向合成许多小片段（称为冈崎片段），然后由 DNA 聚合酶 I 切除片段上的引物，填补片段之间的空缺，最后由连接酶把它们连接成一条完整的子代链，称为滞后链。（3）半不连续复制象这样，在复制叉上新生的 DNA 链一条按 5’→3’的方向（与复制叉移动方向一致）连续合成；另一条则按 5’→3’的方向（与复制叉移动方向相反）不连续合成，称为半不连续复制。 3、终止复制叉从两端进入 ter 位点后，复制终止。由 DNA 聚合酶Ⅰ填补空隙，连接 E 封口。 DNA 复制的高保真度主要是靠 DNA 聚合酶实现的。（1）5’→3’聚合活性部位对底物的选择性，添加的新 dNTP 碱基必须与模板链碱基正确匹配。（2）3’→5’外切活性具有校对或编辑功能，可及时切除参入新链 3’-末端的错误残基。另外，U-糖苷酸，脱碱基核酸内切酶（AP 内切酶）等也参于校对。综上所述：大肠杆菌复制是在几十种酶和蛋白质因子精确配合下完成的，定点起始，两个复制叉双向等速前进，进行半保留，半不连续的复制。（四）真核细胞 DNA 的复制 1、染色质复制（1）真核细胞染色体 DNA 分子为线性的。比原核细胞 DNA 分子大，复制更为复杂。也包括不同的 DNA 聚合酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连接酶、单链结合蛋白和

生物化学:核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第7页共14页多蛋白质因子 (2)为多复制子复制(多起点双向复制),在全部染色体复制完成前,各复制子不能再开始新一轮复制。 (3)在DNA复制的同时另外还要组装成核小体。 2、端粒复制真核生物染色体DNA为线性分子,按DNA复制机制,其滞后链模板5′不能被复制,使已复制出来的新链缩短,从而使染色体端部随复制次数增加而不断缩短。多数生物是通过端粒酶专司端粒的复制,而端粒只有在生殖细胞及受精卵中才有较高的活性端粒酶作用的具体机制尚不清楚,其可能的模式:端粒酶的RNA分子与端粒末端形成氢键,接着,RNA分子作为模板,通过逆转录在DNA3′末端添加6个核苷酸, 随后,端粒酶从DNA分子上解离。新延伸出来的DNA链就可以作为复制模板形成双染色体DNA 、逆转录以RNA为模板,由RNA指导的DNA聚合酶(逆转录E)催化,合成DNA的过程 1、逆转录酶的性质 ①寡聚E ②兼具有三种酶的活力,具有RNA指导的DNA聚合E活力,DNA指导的DNA聚合酶活力和 RNaseh(核糖核酸酶H)活力。 RNaseh:具有5′→3′和3′→5′外切酶活力,可除去DNA、RNA杂交分子中的RNA,同时还具有逆转录酶的活力。是一个酶分子同时具有两种活性。 ③要求有模板和短链RNA引物,dNTP为底物,二价阳离子、和保护_SH的酶。逆转录病毒逆转录过程 RNA(+)→RNA(+)/cDNA(-)→DNA(+)/cDNA(-)→RNA(+) 3、逆转录的生物学意义逆转录过程的发现,不仅扩充了中心法则,还有其重要的生物学意义。它有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解,并对防治肿瘤提供了重要线索。20世纪80年代初发现的一种对人类健康威胁极大的传染病一爱滋病,现已证明它也是一种逆转录病毒引起的,为了了解爱滋病的起因以及寻找防治途径,都需要深入研究这类病 7

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 7 页共 14 页 7 许多蛋白质因子。（2）为多复制子复制（多起点双向复制），在全部染色体复制完成前，各复制子不能再开始新一轮复制。（3）在 DNA 复制的同时另外还要组装成核小体。 2、端粒复制真核生物染色体 DNA 为线性分子，按 DNA 复制机制，其滞后链模板 5′不能被复制，使已复制出来的新链缩短，从而使染色体端部随复制次数增加而不断缩短。多数生物是通过端粒酶专司端粒的复制，而端粒只有在生殖细胞及受精卵中才有较高的活性。端粒酶作用的具体机制尚不清楚，其可能的模式：端粒酶的 RNA 分子与端粒末端形成氢键，接着，RNA 分子作为模板，通过逆转录在 DNA3′末端添加 6 个核苷酸，随后，端粒酶从 DNA 分子上解离。新延伸出来的 DNA 链就可以作为复制模板形成双链染色体 DNA。二、逆转录以 RNA 为模板，由 RNA 指导的 DNA 聚合酶（逆转录 E）催化，合成 DNA 的过程。 1、逆转录酶的性质 ①寡聚 E ②兼具有三种酶的活力，具有 RNA 指导的 DNA 聚合 E 活力，DNA 指导的 DNA 聚合酶活力和 RNaseH（核糖核酸酶 H）活力。RNaseH：具有 5′→3′和 3′→5′外切酶活力，可除去 DNA、RNA 杂交分子中的 RNA，同时还具有逆转录酶的活力。是一个酶分子同时具有两种活性。 ③要求有模板和短链 RNA 引物，dNTP 为底物，二价阳离子、和保护—SH 的酶。 2、逆转录病毒逆转录过程 RNA（+）→RNA（+）/cDNA（-）→DNA（+）/cDNA（-）→RNA（+） 3、逆转录的生物学意义逆转录过程的发现，不仅扩充了中心法则，还有其重要的生物学意义。它有助于人们对 RNA 病毒致癌机制的了解，并对防治肿瘤提供了重要线索。20 世纪 80 年代初发现的一种对人类健康威胁极大的传染病—爱滋病，现已证明它也是一种逆转录病毒引起的，为了了解爱滋病的起因以及寻找防治途径，都需要深入研究这类病

生物化学:核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第9页共14页 (3)切除:5′—核酸外切酶切去嘧啶二聚体片段。 (4)连接:连接酶将新合成的DNA链与原来的DNA链连在一起。 3、重组修复有结构损伤的DNA没修复,仍可进行复制。只是在新合成的子链中与模板损失部位相对应的地方因受阻而留下缺口,在重组酶作用,带缺口的DNA与完整的娣妹双链进行重组交换,用相应的DNA片段填补小链缺口实质:损伤的DNA链没有得到修复,只是在生物体内得到了“稀释” 后两种机制不需要光照,因此又称为暗修复第二节RNA的生物合成根据分子遗传的中心法则,RMA处于信息代谢的中心环节:贮存在DNA分子上的遗传信息必须转录到mRNA分子中,才能用来指导蛋白质的合成。同时,rRNA、tRNA 和具有特殊功能的小RNA都是以DNA为模板、在RMNA聚合酶催化下合成的。此外除逆转录病毒,其他RNA病毒均以RNA为模板进行复制。转录在DNA指导下的RNA聚合酶催化下,以DNA的一条链为模板,接照碱基互补配对的原则,以四种MTP为底物,按5′-3′方向合成一条与模板DNA链互补的RNA 链的过程转录为不对称转录:即以一条DNA链一段为模板进行转录。转录起始于DNA模板的一个特定位点,并在一定位点处终止,此转录区域称为转录单位。一个转录单位可以是一个基因,也可以是多个基因。转录的起始是由DNA 的启动子区控制的,而控制终止的部位则称为终止子基因:是遗传物质的最小功能单位。是特定的DNA片段,这些片段中有些是为种或几种蛋白质(酶)的全部AA编码的核苷酸顺序,称为基因或基因组, NA的有意义链和反意义链:在转录中,双股DNA只有一条是模板,称为模板DNA链非编码链反意义链(-)链另一条链则称为非模板DNA链编码链有意义链+)链实验证明:DNA分子上编码链和非编码链是相对的,在同一DNA分子的某些部分基因以这条链作为模板链,而在另一区域别的基因中则以另一条链为模板链。即存在着一组基因与另一组基因模板的改链

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 9 页共 14 页 9 （3）切除：5′—核酸外切酶切去嘧啶二聚体片段。（4）连接：连接酶将新合成的 DNA 链与原来的 DNA 链连在一起。 3、重组修复有结构损伤的 DNA 没修复，仍可进行复制。只是在新合成的子链中与模板损失部位相对应的地方因受阻而留下缺口，在重组酶作用，带缺口的 DNA 与完整的娣妹双链进行重组交换，用相应的 DNA 片段填补小链缺口。实质：损伤的 DNA 链没有得到修复，只是在生物体内得到了“稀释”。后两种机制不需要光照，因此又称为暗修复。第二节 RNA 的生物合成根据分子遗传的中心法则，RNA 处于信息代谢的中心环节：贮存在 DNA 分子上的遗传信息必须转录到 mRNA 分子中，才能用来指导蛋白质的合成。同时，rRNA、tRNA 和具有特殊功能的小 RNA 都是以 DNA 为模板、在 RNA 聚合酶催化下合成的。此外，除逆转录病毒，其他 RNA 病毒均以 RNA 为模板进行复制。一、转录在 DNA 指导下的 RNA 聚合酶催化下，以 DNA 的一条链为模板，接照碱基互补配对的原则，以四种 NTP 为底物，按 5′－3′方向合成一条与模板 DNA 链互补的 RNA 链的过程。转录为不对称转录：即以一条 DNA 链一段为模板进行转录。转录起始于 DNA 模板的一个特定位点，并在一定位点处终止，此转录区域称为转录单位。一个转录单位可以是一个基因，也可以是多个基因。转录的起始是由 DNA 的启动子区控制的，而控制终止的部位则称为终止子。基因：是遗传物质的最小功能单位。是特定的 DNA 片段，这些片段中有些是为一种或几种蛋白质（酶）的全部 AA 编码的核苷酸顺序，称为基因或基因组， DNA 的有意义链和反意义链：在转录中，双股 DNA 只有一条是模板，称为模板 DNA 链非编码链反意义链（-）链另一条链则称为非模板 DNA 链编码链有意义链（+）链实验证明：DNA 分子上编码链和非编码链是相对的，在同一 DNA 分子的某些部分基因以这条链作为模板链，而在另一区域别的基因中则以另一条链为模板链。即存在着一组基因与另一组基因模板的改链

生物化学: 核酸的生物合成山农大生物化学与分子生物学系第 10 页共 14 页 10 转录成的 mRNA 是（+）链。由于 RNA 产物和正链都与模板链反向平行，碱基互补，所以二者的碱基序列相同，虽然在 DNA 正链中的 T 在 RNA 中被 U 代替，通常用正链 DNA 的碱基序列来表示基因的一级结构，转录起点为+1（与 RNA 产物中第一个残基相对应），其上游（5′侧）残基为-1，依此类推。（一）RNA 聚合酶原核生物 RNA 聚合酶：（由 5 个亚基构成）核心酶 a2ββˊ 全酶还含有两个 Zn+ ，不含 6 亚基的酶称为核心酶。 6-因子 6 因子：与启动子结合，参与基因转录的起始，一旦引发 RNA 的合成，就与核心酶 a2ββˊ分离。原核生物只有一种酶，转录三种 RNA（mRNA、rRNA、tRNA）前体。真核生物 RNA 聚合酶：三种，分别转录不同的 RNA。类型 Ⅰ（或 A） Ⅱ（或 B） Ⅲ（或 C）别名 rRNA 聚合酶 hnRNA 聚合酶小分子 RNA 聚合酶转录产物 rRNA 前体 hnRNA（mRNA 前体） tRNA 和 5S rRNA 前体对 a－鹅膏蕈碱的繁感性不敏感抑制（高度敏感）抑制（中度敏感） RNA 聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备校对功能，因此 RNA 转录的保真度比 DNA 复制低的多。（二）转录过程 RNA 的转录为不对称转录，因为转录仅以 DNA 一条链的某一区段为模板。 1、转录的起始启动子：在基因上由 RNA 聚合酶识别、结合并确定转录起始位点的特定序列。一般位于转录起点的上游，约包括 40 个碱基对。根据对 100 多个基因碱基序列的分析，大肠杆菌启动子至少有两处共同顺序：－35 顺序（RNA 聚合酶全酶识别部位，约含 12bp）和－10 顺序（或 TATA 框或 pribnow box，富含 AT，有助于 DNA 双螺旋的局部解链，全酶结合部位）。目前普遍认为，RNA 聚合酶全酶先识别—35 顺序，并与 DNA 结合形成不稳定的

山东农业大学：《生物化学》课程教学资源（教案讲义）第九章 核酸的生物合成中心法则

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