1h,以除HCl,再对H2O(4℃)透析两次,以除丁酮,再对4℃200ml0.lmol/LpH7.0 磷酸盐缓冲液透析1h,中间取出透析袋倒置二次(此时会出现少量白色变性蛋白沉淀) 取出袋内溶液,用800r/min离心l0min(4℃),取上层清液,测体积(脱辅基血红蛋 白 ApoHb),立即存于冰浴。取样稀释10~20倍,作250m-70nm扫描,作峰检测得 A28蛋白吸收峰值,(以0. Imol/L pH70磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白( ApoHb) 的浓度 CApoHb: A23×稀释倍数 (u mol/ml) 13.1 (ApoHb B] E278=13. 1 L/mmol 4.重组高铁血红蛋白 取30 ml ApoHb,用0.01mo/ L Naoh配制5mg/ml的高铁血红素( Hemin,Mw=6515), 计算 Hemin的加入量(过量1.5倍): CAmm×3×651.5 5×103 ×1.5(m1) 缓慢搅拌下,用10~15min滴加所需体积的 Hemin到30 mI ApoHb中,并在冰浴中 再放置1h,用1 mol/L Naoh粗调和0 Imol/L NaOH细调溶液pH=9~10,溶液颜色变为 棕黑色。 再用G-25脱盐柱脱去过量的 Hemin等,脱盐柱用0 I moI/L pH70磷酸盐缓冲液平衡 和洗脱,用量筒收集重组后的高铁血红蛋白,测量总体积,取样稀释后作250nm~700m 扫描,测峰值A405,最后计算重组率 重组率=重组后Amsx稀释倍数x体积×B 重组前A05×稀释倍数×体积 B 脱辅基后所得ApO的总体积 重组所用Apob的总体积 由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图,可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重 组后的效果。211 1 h，以除 HCl，再对 H2O(4℃)透析两次，以除丁酮，再对 4℃ 200 ml 0.1mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液透析 1 h，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。 取出袋内溶液，用 8000r/min 离心 10 min(4℃)，取上层清液，测体积(脱辅基血红蛋 白 ApoHb)，立即存于冰浴。取样稀释 10～20 倍，作 250nm-700nm 扫描，作峰检测得 A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白(ApoHb) 的浓度 CApoHb： ( ) 13.1 278 mol ml A CApoHb μ ／ 稀释倍数 ＝  （ApoHb 的 278=13.1 L/mmol） 4. 重组高铁血红蛋白 取 3.0ml ApoHb，用 0.01mol/L NaOH 配制 5mg/ml 的高铁血红素(Hemin，Mw=651.5) ， 计算 Hemin 的加入量(过量 1.5 倍)： 1.5( ) 5 10 3 651.5 3 ml C V ApoHb     ＝ 缓慢搅拌下，用 10～15min 滴加所需体积的 Hemin 到 3.0ml ApoHb 中，并在冰浴中 再放置 1 h，用 1mol/L NaOH 粗调和 0.1mol/L NaOH 细调溶液 pH=9～10，溶液颜色变为 棕黑色。 再用 G-25 脱盐柱脱去过量的 Hemin 等，脱盐柱用 0.1mol/L pH7.0 磷酸盐缓冲液平衡 和洗脱，用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积，取样稀释后作 250nm～700nm 扫描，测峰值 A405，最后计算重组率： 重组前 稀释倍数 体积 重组后 稀释倍数 体积 重组率＝      405 405 A A B 重组所用 的总体积 脱辅基后所得 的总体积 ＝ ApoHb ApoHb B 由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图，可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重 组后的效果