倍体积的09%NaCl洗血球,再用4000/min离心10min,如此重复2~3次,取下层血 球,按1:∶1(w)体积比加甲苯,振荡2分钟以上,使血球破膜,800r/min离心20mnin, 弃去上层甲苯和中层脂肪,取下层血球沉淀,加10分之一沉淀体积的9%NaCl,激烈振 荡混合,4000r/min离心10min,弃沉淀,取上层红黑色血红蛋白溶液,再用8000r/min 离心 10min,弃上层,取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤,因过滤很慢,可放4℃冰箱内过 滤过夜,然后装透析袋,4℃对H2O透析除NaCl和甲苯,换2~3次予冷的H2O,由透 析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶,取样分析血红蛋白(Hb)的浓度:取5uHb,加 30mlH2O稀释601倍),用分光光度计作250m~700m的扫描,并检测Hb在415rm 54nm和576m处的三个特征峰值:A41s、As41和A5,已知这三个特征峰的吸光系数值 E415=125 I/mmol、E541=13.5mmol、576=14.6mmol。 由公式:浓度C=(A×稀释倍数yε,即可计算出制备的氧合血红蛋白Hb的浓度Chbe 2.氧合血红蛋白Hb)氧化成高铁血红蛋白 取已知浓度(约3~6mmo/L)的氧合血红蛋白2ml,置于5m小烧杯或10ml试管内 放入冰浴,用下式计算需加入过量1.3倍的KFe(CNb的量(l0mg/m)(M=329.26) Cm4×2×32926 1.3(m) 10×10 用移液管吸取所需加入的KFe(CN)6,在缓慢搅拌下滴入Hb内,直到血红蛋白的颜 色从鲜红色变成棕黑色。 装一根1.8cm×2cm的 Sephadex G-25凝胶脱盐柱,用10 mmol/L pH70的磷酸盐缓 冲液平衡脱盐柱,将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱,用4℃H2O洗脱,用量筒收集高 铁血红蛋白,再用H2O将其稀释至10~1.5mmoL(因为过浓不利于脱辅基,太稀又会 脱不完全),记录总体积,取样稀释200~300倍,作250~700nm的扫描,得重组前高 铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图,检测峰值Ao5 3脱辅基(以下步骤均在冰浴或4℃下进行) 高铁血红蛋白用10mol/LHCl粗调,再用o. Imol/L HCI细调溶液pH=1.8~20(这 步是关键,pH太高,脱辅基不完全,pH过低蛋白会变性),将溶液置入具塞试管内,加 入等体积予冷丁酮,手摇振荡萃取,静止分层,弃上层丁酮,取下层溶液,如此反复萃 取几次,直至上层丁酮无色为止。 取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋,4℃对1L5 mmol/L NaHCO3透析0.5 210210 倍体积的 0.9% NaCl 洗血球，再用 4000r/min 离心 10min，如此重复 2～3 次，取下层血 球，按 1∶1(v/v)体积比加甲苯，振荡 2 分钟以上，使血球破膜，8000r/min 离心 20min， 弃去上层甲苯和中层脂肪，取下层血球沉淀，加 10 分之一沉淀体积的 9% NaCl，激烈振 荡混合，4000r/min 离心 10min，弃沉淀，取上层红黑色血红蛋白溶液，再用 8000r/min 离心 10min，弃上层，取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤，因过滤很慢，可放 4℃冰箱内过 滤过夜，然后装透析袋，4℃对 H2O 透析除 NaCl 和甲苯，换 2～3 次予冷的 H2O，由透 析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶，取样分析血红蛋白(Hb)的浓度：取 5l Hb，加 3.0ml H2O(稀释 601 倍)，用分光光度计作 250nm～700nm 的扫描，并检测 Hb 在 415nm、 541nm 和 576nm 处的三个特征峰值：A415、A541和 A576，已知这三个特征峰的吸光系数值 为： 415 =125 l/mmol、541 =13.5 l/mmol、576 =14.6 l/mmol。 由公式： 浓度 C=(A×稀释倍数)/ ，即可计算出制备的氧合血红蛋白 Hb 的浓度 CHb。 2. 氧合血红蛋白(Hb)氧化成高铁血红蛋白 取已知浓度(约 3～6 mmol/L)的氧合血红蛋白 2 ml，置于 5 ml 小烧杯或 10 ml 试管内 放入冰浴，用下式计算需加入过量 1.3 倍的 K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26)： 1.3( ) 10 10 2 329.26 3 ml C V Hb     ＝ 用移液管吸取所需加入的 K3Fe(CN)6，在缓慢搅拌下滴入 Hb 内，直到血红蛋白的颜 色从鲜红色变成棕黑色。 装一根 1.8cm×22cm 的 Sephadex G-25 凝胶脱盐柱，用 10mmol/L pH7.0 的磷酸盐缓 冲液平衡脱盐柱，将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱，用 4℃H2O 洗脱，用量筒收集高 铁血红蛋白，再用 H2O 将其稀释至 1.0～1.5mmol/L (因为过浓不利于脱辅基，太稀又会 脱不完全)，记录总体积，取样稀释 200～300 倍，作 250～700nm 的扫描，得重组前高 铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图，检测峰值 A405。 3.脱辅基 (以下步骤均在冰浴或 4℃下进行) 高铁血红蛋白用 1.0mol/L HCl 粗调，再用 0.1mol/L HCl 细调溶液 pH=1.8～2.0 (这一 步是关键，pH 太高，脱辅基不完全，pH 过低蛋白会变性)，将溶液置入具塞试管内，加 入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃 取几次，直至上层丁酮无色为止。 取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋，4℃对 1L 5 mmol/L NaHCO3 透析 0.5～