8克半干滤并,放一小烧杯中,加入等体积的2mol/Lpl=10.5 NaHco3缓冲溶液,外置 冰浴,在通风厨内于电磁搅拌器上轻轻地进行搅拌,然后再缓慢加CNBr一乙腈溶液3m (含CNBr1g/ml乙腈),边测pH,通过逐滴加入2mo/ L NaOh,始终维持pH在10.5 左右,待CNBr一乙腈溶液加完并且pH不再明显变化时,即可终止反应(一般在30-3 分钟内完成)。立即投入少许冰块,取出并迅速转移至G2玻璃烧结漏斗中抽滤,用大量 冰水洗,最后用冷的0. mol/L pH=95 NaHco3缓冲溶液洗,其用量约为凝胶体积的10~15 倍。接着抽干待用。 2.鸡卵粘蛋白的偶联:将30ml(约0.5g蛋白质)对0.1 mol/L pH=9.5 NaHco3透 析平衡过的鸡卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝胶中,室温缓慢搅拌反应6小时,这 步动作要快,从载体活化后到加入配基的时间最好不超过2分钟,因活化好的载体极不 稳定,易变成无活性的产物 反应6小时后取出抽滤,先用大量去离子水洗,然后用20ml1molL乙醇胺(pH 9~9.5)封闭残存的活性基团,室温搅拌反应2小时,抽滤。再用凝胶体积2-3倍的02moL 甲酸和0. Imol/L pH=8.3Tis-HCl缓冲液交替洗涤,直到流出液中A280~0.05为止。抽 干后用005mol/Lp=83 Tris-HCl Buffer浸泡然后置冰箱中待用 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应式如下: 附录二:酶活力的测定 1.胰蛋白酶活力的测定:本实验以苯甲酰L一精氨酸乙酯(英文缩写为BAEE)为 底物,用紫外吸收法进行测定。方法如下: 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯,先在一只杯中加入25℃予热过的20m缓 冲液(005 mol/L pH=80 Tris-HCI Buffer含0.2%CaCl2)。0.2m10001mo/LHCl,然后再 加08 mI BAEE-005 mol/L pH=80 Tris-HCI Buffer(含02%CaCl和1 mmoL/L BAEE)作 为空白,校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液(用 量一般为10微克结晶的胰蛋白酶),立即混匀并记时(杯内已有20ml缓冲液和08ml BAEE溶液)。每半分钟读数一次,共读3~4分钟。若ΔA2s/min>0400,则酶液应当稀释 或减量,控制AA25/min在0.05~0.100左右为宜。254 8 克半干滤并，放一小烧杯中，加入等体积的 2mol/L pH = 10.5 NaHCO3 缓冲溶液，外置 一冰浴，在通风厨内于电磁搅拌器上轻轻地进行搅拌，然后再缓慢加 CNBr—乙腈溶液 3ml （含 CNBr 1g / ml 乙腈），边测 pH，通过逐滴加入 2mol/L NaOH，始终维持 pH 在 10.5 左右，待 CNBr—乙腈溶液加完并且 pH 不再明显变化时，即可终止反应（一般在 30~35 分钟内完成）。立即投入少许冰块，取出并迅速转移至 G2 玻璃烧结漏斗中抽滤，用大量 冰水洗，最后用冷的0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 缓冲溶液洗，其用量约为凝胶体积的10~15 倍。接着抽干待用。 2. 鸡卵粘蛋白的偶联：将 30ml（约 0.5g 蛋白质）对 0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 透 析平衡过的鸡卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝胶中，室温缓慢搅拌反应 6 小时，这一 步动作要快，从载体活化后到加入配基的时间最好不超过 2 分钟，因活化好的载体极不 稳定，易变成无活性的产物。 反应 6 小时后取出抽滤，先用大量去离子水洗，然后用 20ml 1mol/L 乙醇胺（pH = 9~9.5）封闭残存的活性基团，室温搅拌反应 2 小时，抽滤。再用凝胶体积 2~3 倍的 0.2mol/L 甲酸和 0.1mol/L pH = 8.3 Tris—HCl 缓冲液交替洗涤，直到流出液中 A280<0.05 为止。抽 干后用 0.05mol/L pH = 8.3 Tris-HCl Buffer 浸泡,然后置冰箱中待用。 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应式如下： 附录二： 酶活力的测定 1. 胰蛋白酶活力的测定：本实验以苯甲酰 L—精氨酸乙酯（英文缩写为 BAEE）为 底物，用紫外吸收法进行测定。方法如下： 取 2 个光程为 1 厘米的带盖石英比色杯，先在一只杯中加入 25℃予热过的 2.0ml 缓 冲液（0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer,含 0.2%CaCl2）。0.2ml 0.001mol/L HCl，然后再 加 0.8ml BAEE-0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer（含 0.2%CaCl2 和 1mmol/L BAEE）作 为空白，校正仪器的 253nm 处光吸收零点。再在另一比色杯中加入 0.2ml 待测酶液（用 量一般为 10 微克结晶的胰蛋白酶），立即混匀并记时（杯内已有 2.0ml 缓冲液和 0.8ml BAEE 溶液）。每半分钟读数一次，共读 3~4 分钟。若A253/min>0.400，则酶液应当稀释 或减量，控制A253/min 在 0.05 ~ 0.100 左右为宜