2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越,可优先使用。 3.用改良法时,欲得到好的涂片,首先要制备浓稠的菌液,其次是从小试管中取染色的菌液时,应先用接种 环充分搅拌,然后再挑取菌液,否则菌体沉于管底,涂片时菌体太少。 实验六细菌的鞭毛染色 (一)实验目的:学习细菌的鞭毛染色法 (二)实验原理:细菌的鞭毛极细,直径一般为10-20n,只有用电子显微镜才能观察到。但是,如采用 特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多,但其基本原理相同,即在染色前先 用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁 或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法 (三)实验番材 1.活材料:培养12-16h的水稻黄单胞菌( anthomonas oryzae),粘质赛氏杆菌( Serratia marcescens) 或假单细胞菌( Pseudomonas sp.)斜面菌种 2.染色液和试剂:硝酸银染色液(见附二、(一)、8)、 Leifson染色液(见附二、(-—)、9)、香柏 油、二甲苯 3.器材:载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环,显微镜。 (四)实验方法 1.镀银法染色 (1)清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。为了避免玻片相互重叠,应将玻片插在专用金属 架上,然后将玻片置洗衣粉过滤液中(洗衣粉煮沸后用滤纸过滤,以除去粗颗粒),煮沸20min。取出稍冷 后用自来水冲洗、晾干,再放入浓洗液中浸泡5-6天,使用前取出玻片,用自来水冲去残酸,再用蒸馏水 洗。将水沥干后,放入95%乙醇中脱水 (2)菌液的制备及制片:菌龄较老的细菌容易失落鞭毛,所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋 白胨培养基斜面上(培养基表面湿润,斜面基部含有冷凝水)连续移接3-5代,以増强细菌的运动力。最后 代菌种放恒温箱中培养12-16h。然后,用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环,移至盛有1-2mL 无菌水的试管中,使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min(放置时间不宜太长,否则鞭 毛会脱落),让幼龄菌的鞭毛松展开。然后,吸取少量菌液滴在洁浄玻片的一端,立即将玻片倾斜,使菌液 缓慢地流向另一端,用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿 中,待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌,恒温培养12-16h后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 (3)染色 ①滴加A液,染4-6min ②用蒸馏水充分洗净A液 ③用B液冲去残水,再加B液于玻片上,在酒精灯火焰上加热至冒气,约维持0.5-1min(加热时应随时补 充蒸发掉的染料,不可使玻片出现干涸区 ④用蒸馏水洗,自然干燥。 (4)镜检:先低倍,再高倍,最后用油镜检查。 结果:菌体呈深褐色,鞭毛呈浅褐色。 2.改良 Leifson染色法 (1)清洗玻片法同1。 (2)配制染料见附录二(一)9。染料配好后要过滤15-20次后染色效果才好 (3)菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同1。 ②用记号笔在洁净的玻片上划分3-4个相等的区域。2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。 3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种 环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。 实验六 细菌的鞭毛染色 （一）实验目的：学习细菌的鞭毛染色法 （二）实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为 10—20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用 特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先 用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁 或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。 （三）实验器材 1.活材料：培养 12-16h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens） 或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。 2.染色液和试剂：硝酸银染色液（见附二、（一）、8）、Leifson 染色液（见附二、（一—）、9）、香柏 油、二甲苯。 3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。 （四）实验方法 1.镀银法染色 （1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属 架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸 20min。取出稍冷 后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡 5—6 天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水 洗。将水沥干后，放入 95%乙醇中脱水。 （2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋 白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接 3-5 代，以增强细菌的运动力。最后 一代菌种放恒温箱中培养 12—16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有 1—2mL 无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在 37℃恒温箱中静置 10min（放置时间不宜太长，否则鞭 毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液 缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放空气中自然干燥。 用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将 0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿 中，待凝固后在平板中央点接活化了 3-4 代的细菌，恒温培养 12-16h 后，取扩散菌落的边缘制作涂片。 （3）染色 ①滴加 A 液，染 4—6min。 ②用蒸馏水充分洗净 A 液。 ③用 B 液冲去残水，再加 B 液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持 0.5—1min（加热时应随时补 充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。 ④用蒸馏水洗，自然干燥。 （4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 2.改良 Leifson 染色法 （1）清洗玻片法同 1。 （2）配制染料 见附录二（一）9。染料配好后要过滤 15-20 次后染色效果才好。 （3）菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同 1。 ②用记号笔在洁净的玻片上划分 3—4 个相等的区域